原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)葉肉(rou)細(xi)胞(bao)瞬(shun)時表(biao)達方(fang)法

1、 生(sheng)長(chang)培養(yang)好(hao)的(de)試(shi)驗(yan)材(cai)料（壹般(ban)為生(sheng)長(chang)20天左右(you)的(de)擬(ni)南(nan)芥幼(you)苗葉片）

2、 在(zai)擬南(nan)芥開花前取樣(yang)（30片葉子左右(you)即可(ke)）

3、 切取葉片為(wei)0.5-1mm的(de)細(xi)條(tiao)（如(ru)果材(cai)料能(neng)達(da)到(dao)每克10⁷個(ge)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)， 10-20片葉子需(xu)要5-10mL酶解液(ye)）

4、 迅(xun)速(su)將(jiang)切(qie)下(xia)的(de)樣(yang)品轉到酶解液(ye)中(zhong)，要求(qiu)全(quan)部(bu)浸(jin)沒。

5、 黑(hei)暗(an)條(tiao)件下抽真(zhen)空(kong)30min。

6、 連(lian)續(xu)酶解，室(shi)溫(wen)下(xia)23℃黑(hei)暗(an)中(zhong)靜止酶解3h

7、 利用(yong)光學(xue)顯(xian)微(wei)鏡檢(jian)查原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)（30-50μm大小(xiao)）

8、 在(zai)過濾(lv)前加(jia)入等量的(de)W5溶液(ye)

9、 洗(xi)幹(gan)凈(jing)濾(lv)網(wang)，並(bing)用W5潤濕(shi)，之(zhi)後(hou)過濾(lv)

10、 離(li)心(xin)100g，1-2min沈澱(dian)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)，盡可(ke)能(neng)吸(xi)走(zou)上(shang)清，重復洗(xi)2 次

11、 重懸(xuan)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)於W5中(zhong)，保持(chi)在(zai)2*10⁵個(ge) /ml，冰(bing)浴30min。

12、 100g離(li)心(xin)2min，盡可(ke)能(neng)吸(xi)走(zou)上(shang)清，利(li)用(yong)MMG重懸(xuan)，濃度(du)約 2*10⁵個(ge)/ml

13、 加入10μL質(zhi)粒（1000ng-2000ng ）於2ml離(li)心(xin)管中(zhong)

14、 加入100μL原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)（2*10⁴個(ge)），輕輕(qing)混(hun)勻(yun)。

15、 加110μL PEG solution，輕彈(dan)使(shi)充分混(hun)勻(yun)

16、 23℃室(shi)溫(wen)孵(fu)育(yu)30min。

17、 加400-440μL W5混(hun)勻(yun)，終止反(fan)應

18、 100g，2min 23℃離(li)心(xin)，去上(shang)清，重復洗(xi)壹(yi)次(ci)

19、 用1mL W5重懸(xuan)原(yuan)生(sheng)質(zhi)體(ti)並(bing)放入6孔板中(zhong)培養(yang)

20、 20-25℃孵(fu)育(yu)16h以上(shang)

21、 取樣(yang)制(zhi)片觀(guan)察(cha)

溶液(ye)配(pei)制：

1、 酶解液(ye)的(de)配(pei)制（20ml）

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