全(quan)自動細(xi)胞計(ji)數(shu)儀-細(xi)胞計(ji)數(shu)方(fang)法

       細(xi)胞計(ji)數(shu)是(shi)確定(ding)培(pei)養中鋪板(ban)的細(xi)胞濃度、確(que)定(ding)細(xi)胞活力(li)和評(ping)估細(xi)胞分(fen)離(li)程(cheng)序結(jie)果的壹個組成(cheng)部分(fen)。建議在(zai)細(xi)胞分(fen)離(li)之(zhi)前進行初始(shi)細(xi)胞計(ji)數(shu)；然(ran)後(hou)可(ke)以將(jiang)該數(shu)字(zi)與(yu)細(xi)胞分(fen)離(li)後(hou)的(de)細(xi)胞計(ji)數(shu)進(jin)行(xing)比較，以計(ji)算(suan)細(xi)胞恢(hui)復(fu)率(lv)。此外(wai)，當(dang)預期細(xi)胞活力(li)可(ke)能(neng)會(hui)降低時(shi)，應進行活細(xi)胞計(ji)數(shu)，例(li)如，在(zai)處理(li)冷凍保(bao)存的細(xi)胞或離體操(cao)作的細(xi)胞時(shi)。本文(wen)描述(shu)了(le)如何(he)使用(yong)3%乙酸(suan)和亞-CH3藍進行總(zong)有核(he)細(xi)胞計(ji)數(shu)，以及如何(he)通過(guo)臺(tai)盼(pan)藍(lan)染(ran)料(liao)排除進行活細(xi)胞計(ji)數(shu)。
 
　　實驗步驟(zhou)和方(fang)法：
 
　　I部分(fen)：樣品(pin)制(zhi)備
 
　　選項1：用(yong)3%乙酸(suan)和亞-CH3藍對總(zong)有核(he)細(xi)胞計(ji)數(shu)進(jin)行(xing)細(xi)胞稀釋(shi)
 
　　使用(yong)磷(lin)酸鹽緩沖(chong)鹽水或無血清培養基對充(chong)分(fen)混(hun)合(he)的(de)單(dan)細(xi)胞懸浮(fu)液進(jin)行(xing)適當(dang)稀釋(shi)。為了(le)準確(que)表示濃(nong)度，請(qing)使用(yong)至少(shao)20μL的(de)細(xi)胞懸浮(fu)液進(jin)行(xing)稀釋(shi)。
 
　　示例(li)：制備10倍(bei)稀釋(shi)液
 
　　在(zai)微(wei)量(liang)離心管或96孔板(ban)的(de)孔中加入(ru)180μL的3%乙酸(suan)和亞-CH3藍。混(hun)合(he)細(xi)胞懸浮(fu)液，將(jiang)20μL添加(jia)到(dao)含有3%乙酸(suan)和亞-CH3藍的試管(guan)或孔中。
 
　　選項2：通(tong)過(guo)臺(tai)盼(pan)藍(lan)染(ran)料(liao)排除對活細(xi)胞計(ji)數(shu)進(jin)行(xing)細(xi)胞稀釋(shi)
 
　　確保(bao)要(yao)計(ji)數(shu)的(de)細(xi)胞懸浮(fu)液*重(zhong)新(xin)懸浮(fu)。在細(xi)胞沈(chen)降之前，將(jiang)適量(liang)的細(xi)胞懸液(20-200μL)放入(ru)離心(xin)管中。加入(ru)等體積(ji)的0.4%臺(tai)盼藍並輕(qing)輕(qing)混(hun)合(he)。將(jiang)混(hun)合(he)物在室溫(15°C–25°C)下孵育5分(fen)鐘(zhong)。
 
　　II部分(fen)：使(shi)用(yong)血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)進(jin)行(xing)細(xi)胞計(ji)數(shu)
 
　　通(tong)過(guo)用(yong)70%C2H6O清潔腔室表面來制備血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)。擦(ca)幹。將(jiang)蓋玻(bo)片(pian)放在(zai)腔(qiang)室上。
 
　　使(shi)用(yong)20μL移液器(qi)重(zhong)新懸浮(fu)細(xi)胞混(hun)合(he)物，並將(jiang)10μL的染(ran)色(se)細(xi)胞放入(ru)血細(xi)胞計(ji)室。
 
　　註意：小心不(bu)要(yao)移(yi)動蓋玻(bo)片(pian)。允許毛細(xi)作用(yong)將(jiang)樣品(pin)吸入(ru)。
 
　　將(jiang)血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)放在(zai)雙(shuang)目(mu)光學(xue)顯微鏡(jing)的載(zai)物臺上(shang)。將(jiang)顯微(wei)鏡(jing)調(tiao)整到10倍(bei)放大(da)倍(bei)率(lv)並聚(ju)焦(jiao)在(zai)細(xi)胞上。
 
　　使(shi)用(yong)手動計(ji)數(shu)計(ji)數(shu)器(qi)，計(ji)算(suan)血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)四個外(wai)部正(zheng)方(fang)形(xing)中的每(mei)壹個中的細(xi)胞（染色(se)的細(xi)胞核(he)）（圖1A），包括位(wei)於底(di)部和左(zuo)側(ce)周(zhou)邊(bian)的細(xi)胞，但不(bu)包括位(wei)於頂(ding)部和右手(shou)邊（圖1B）。如果在第(di)壹部分(fen)中使用(yong)了(le)3%乙酸(suan)和亞-CH3藍，則計(ji)算(suan)染色(se)的(de)細(xi)胞核(he)。如果在第(di)壹部分(fen)中使用(yong)了(le)臺盼(pan)藍(lan)，則(ze)計(ji)算(suan)未染(ran)色(se)的活細(xi)胞。
  
細(xi)胞計(ji)數(shu)儀
 
 
　　血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)圖(tu)指示（A）四組紅色(se)和（B）其(qi)中壹組應用(yong)於計(ji)數(shu)的(de)16個(ge)方(fang)塊(kuai)。
 
　　註意：適當的稀釋(shi)系數(shu)將(jiang)取決(jue)於起(qi)始(shi)樣本(ben)中存在的(de)大(da)致細(xi)胞數(shu)量(liang)，但應使血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)中的細(xi)胞濃度為每平方(fang)（即(ji)大或主要(yao)正(zheng)方(fang)形(xing)）50-100個細(xi)胞。如果血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)上(shang)每(mei)個(ge)主要(yao)正(zheng)方(fang)形(xing)的細(xi)胞多於或少(shao)於大(da)約(yue)100個(ge)，請(qing)使用(yong)更大(da)或更小的稀釋(shi)因(yin)子(zi)制備新(xin)的(de)稀釋(shi)樣品(pin)。
 
　　血細(xi)胞計(ji)數(shu)器(qi)的(de)九個主要(yao)方(fang)塊(kuai)中的每(mei)壹個都代(dai)表(biao)0.1mm3的總(zong)體積(ji)。由(you)於1cm3相(xiang)當於1mL，因(yin)此可(ke)以使用(yong)以下等式確(que)定(ding)細(xi)胞濃度：
 
　　有核(he)細(xi)胞總(zong)數(shu)/mL=每(mei)平方(fang)平均細(xi)胞數(shu)x稀釋(shi)因(yin)子(zi)x104
 
　　示例(li)：如果四個外(wai)部方(fang)塊(kuai)中的每(mei)壹個的細(xi)胞計(ji)數(shu)在(zai)100稀釋(shi)因(yin)子(zi)下分(fen)別(bie)為21、15、20和17，則平均細(xi)胞計(ji)數(shu)將(jiang)為(21+15+20+17)÷4=18.25。
 
　　因(yin)此，原(yuan)始(shi)懸浮(fu)液中細(xi)胞的總(zong)濃(nong)度為：18.25x100x10^4=18,250,000個細(xi)胞/mL。
 
　　使用(yong)人工的(de)細(xi)胞計(ji)數(shu)方(fang)法誤(wu)差率(lv)較高，為提高細(xi)胞計(ji)數(shu)的(de)準確(que)度和細(xi)胞計(ji)數(shu)效(xiao)率(lv)可以使用(yong)細(xi)胞計(ji)數(shu)儀進行細(xi)胞計(ji)數(shu)。博大博聚(ju)旗(qi)下的細(xi)胞計(ji)數(shu)儀系列，具有多種規格供選擇，可以滿足不(bu)同的用(yong)戶(hu)需求。

蘇(su)州阿(e)爾法生(sheng)物提供的細(xi)胞計(ji)數(shu)儀包括：全自(zi)動細(xi)胞計(ji)數(shu)儀，博大博聚(ju)細(xi)胞計(ji)數(shu)儀，熒光細(xi)胞計(ji)數(shu)儀，血球計(ji)數(shu)儀等。