SDS堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)制備(bei)質(zhi)粒DNA簡介(jie)

   近些(xie)年來，隨(sui)著PCR技術的出現(xian)，以(yi)及(ji)DNA克隆和測序方法(fa)的發(fa)展，對大量質(zhi)粒載 體和重(zhong)組子(zi)的需(xu)求(qiu)也大大減少。
  在本(ben)方案中(zhong)，通(tong)過 堿(jian)裂(lie)解(jie)法(fa)的放大（Birnboim and Doly 1979）,質(zhi)粒DNA可從清亮(liang)的細(xi)菌(jun)裂(lie)解(jie)物中通過(guo)含(han)有(you) 漠化乙錠(ding)的CsCl梯(ti)度離心來進(jin)行(xing)純(chun)化。
  無(wu)論(lun)是高拷貝(bei)數(shu)的質(zhi)粒還(hai)是(shi)低(di)拷(kao)貝數(shu)的質(zhi)粒，通過這種(zhong)方(fang)法可以(yi)得(de)到(dao)每(mei)毫升3〜5^g 的DNA。重(zhong)組子(zi)的質(zhi)粒壹般產量較(jiao)少，這取(qu)決於(yu)克隆的DNA片段(duan)的大小和特(te)點(dian)。
材(cai)料
為(wei)正確使(shi)用本(ben)方案中(zhong)的器(qi)材(cai)和危(wei)險試(shi)劑(ji)，必須(xu)查閱相(xiang)應(ying)的材(cai)料安全(quan)數(shu)據表(biao)並(bing)咨詢所在(zai)機(ji)構的環(huan)境(jing)衛生(sheng)和安全(quan)辦公(gong)室(shi)。
儲備(bei)溶(rong)液(ye)應(ying)稀釋(shi)至(zhi)適用(yong)濃度後使(shi)用。
試(shi)劑(ji)
瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠（見步驟(zhou)8和(he)19）
堿(jian)裂(lie)解(jie)液(ye)I<A>
若(ruo)用(yong)柱(zhu)層(ceng)析進(jin)壹步(bu)純(chun)化所制(zhi)備(bei)的質(zhi)粒DNA （見本(ben)章導言(yan)中"純(chun)化DNA的商業(ye)試(shi)劑(ji)盒”部(bu)分），無菌(jun)的堿(jian)裂(lie)解(jie) 液(ye)I在(zai)使(shi)用前(qian)可補充適當(dang)體積的無(wu)DNA酶的RNA酶（20mg/mL,胰(yi)RNA酶），使(shi)終濃度為lOOpg/mL,若(ruo)用(yong)其(qi)他(ta) 方(fang)法(fa)純(chun)化DNA,不(bu)推(tui)薦在(zai)此步(bu)驟中加RNA酶。
堿裂(lie)解(jie)液(ye)II<A>
現(xian)配現(xian)用，室溫使(shi)用。
堿(jian)裂(lie)解(jie)液(ye)III<A>
用(yong)於(yu)篩選(xuan)質(zhi)粒的抗(kang)生(sheng)素(su)
轉化了(le)目(mu)的質(zhi)粒的細(xi)菌(jun)克隆
氯(lv)黴素(su)（34mg/mL）（可(ke)選(xuan)；見步(bu)驟(zhou)4）
乙醇(chun)
異(yi)丙醇(chun)
溶(rong)菌(jun)酶（10mg/mL）
限(xian)制性(xing)內(nei)切(qie)核(he)酸酶
培(pei)養基(ji)（LB、YT 或(huo)者(zhe) Terrific Broth） <A>,預熱到(dao) 37°C
STE<A>,冰(bing)浴(yu)
TE （pH8.0） <A>
附加試(shi)劑(ji)
步驟(zhou)8和步驟19需要(yao)第(di)2章方案1中(zhong)列(lie)出的試(shi)劑(ji)。步驟(zhou)18需要(yao)柱(zhu)層(ceng)析所用(yong)材(cai)料（見(jian) 本(ben)章導言(yan)）。
設(she)備(bei)
有蓋的培(pei)養瓶(ping)（125mL, 2L）
知(zhi)楚(chu)搖床(chuang)，預設(she)到(dao)37°C
RC6 Plus離(li)心機帶(dai)轉頭(tou)，合(he)適容量(liang)（Thermo Scientific）
分光(guang)光(guang)度計
實(shi)驗方(fang)法
細(xi)胞(bao)制(zhi)備(bei)

• 挑取(qu)轉化的細(xi)菌(jun)單(dan)菌落或(huo)用(yong)0.1〜l.OmL單菌(jun)落的培(pei)養物，接(jie)種(zhong)到(dao)30mL含(han)有適當(dang) 抗生素的培(pei)養基(ji)中(zhong)（LB、YT或(huo)者Terrific Broth）o

為確保培(pei)養物通氣良(liang)好(hao)：
・試(shi)管的體積應(ying)該(gai)至(zhi)少比(bi)細(xi)菌(jun)培(pei)養物的體積大4倍。試(shi)管蓋要(yao)蓋得(de)松些(xie)。
•培(pei)養物要(yao)在(zai)劇烈(lie)振(zhen)蕩下(xia)培(pei)養。

• 在(zai)適(shi)當(dang)的溫度和搖速下(xia)培(pei)養菌(jun)液(ye)直至(zhi)對數(shu)生長(chang)期(qi)晚(wan)期(qi)（OD6oo約(yue)為0.6）。

• 在含有(you)500mL的LB、YT或(huo)者(zhe)Terrific Broth培(pei)養液(ye)（預(yu)熱(re)到(dao)37°C ）及(ji)適當(dang)抗生素 的燒(shao)瓶(ping)（2L）中(zhong)接(jie)種(zhong)25mL對數(shu)生長(chang)期(qi)晚(wan)期(qi)的菌(jun)液(ye)。將(jiang)此(ci)培(pei)養液(ye)在(zai)37°C劇烈(lie)振(zhen)蕩（300cycles/ min）,培(pei)養 2.5h»

最(zui)後(hou)菌(jun)液(ye)的ODao應(ying)為(wei)0.4。由(you)於不(bu)同(tong)菌(jun)株(zhu)的生(sheng)長(chang)速度不同(tong)，可(ke)稍(shao)微延(yan)長(chang)或(huo)縮(suo)短(duan)培(pei)養時(shi)間，使(shi)最終的OD值(zhi)為(wei)0.4。

• 若(ruo)質(zhi)粒為低(di)或(huo)中拷貝數(shu)的質(zhi)粒，在培(pei)養液(ye)中(zhong)加2.5mL濃度為34mg/mL的氯(lv)黴素(su)， 使(shi)其(qi)終濃度為170ng/mLo

A對於高拷貝(bei)數(shu)質(zhi)粒，不必添加氯(lv)黴素(su)。

• 在(zai) 37°C 以(yi) 300cycles/min 振(zhen)蕩 12~16h。

• 取部分菌液(ye)（1〜2mL）到(dao)離(li)心管中(zhong)，4°C儲存。2700g離心15min以(yi)收集(ji)余下(xia)的近 500mL培(pei)養物。棄上清，倒(dao)置(zhi)離心管使(shi)殘余上清流(liu)出。

• 用(yong)200mL冰(bing)預(yu)冷的STE重(zhong)懸(xuan)細(xi)菌(jun)沈澱，按(an)步驟6所述(shu)重(zhong)新(xin)收集細(xi)菌(jun)並(bing)儲存在-20°C。

• 采用(yong)方(fang)案1中(zhong)的方(fang)法(fa)或(huo)使(shi)用商品(pin)化試(shi)劑(ji)盒，從(cong)步(bu)驟6中(zhong)取出的1〜2mL菌(jun)液(ye)中(zhong)提(ti)取(qu) 質(zhi)粒，並釆(釆)用酶切和(he)瓊(qiong)脂(zhi)糖電泳分析此(ci)少量(liang)制備(bei)的質(zhi)粒DNA,以(yi)確定(ding)大量培(pei)養菌(jun)液(ye)中(zhong)獲(huo)得(de) 的質(zhi)粒正確。

設(she)置(zhi)這種(zhong)對照可能(neng)看(kan)上去(qu)有(you)點(dian)過(guo)於謹(jin)慎，然而(er)它(ta)可(ke)以(yi)避免發(fa)生(sheng)某(mou)些(xie)難以(yi)挽(wan)回(hui)的、浪(lang)費(fei)大量時(shi)間的錯誤。
細(xi)胞(bao)裂(lie)解(jie)

• 將(jiang)步驟7中凍(dong)存的細(xi)菌(jun)在(zai)室溫下(xia)放置5〜lOmin使(shi)其(qi)解(jie)凍(dong)，用18mL （10mL）堿裂(lie) 解(jie)液(ye)I重(zhong)懸(xuan)。

如果步驟4中使(shi)用了(le)氯(lv)黴素(su)的菌(jun)液(ye)，則(ze)使(shi)用括(kuo)號中(zhong)的體積數(shu)。
10. 加2mL （ImL）新(xin)配制的10mg/mL溶(rong)菌(jun)酶。

• 加40mL （20mL）新(xin)配制的堿(jian)裂(lie)解(jie)液(ye)II。蓋上離(li)心管蓋，輕(qing)輕(qing)顛倒(dao)數(shu)次，混(hun) 勻，室(shi)溫放置5~10min。

延(yan)長(chang)超(chao)螺(luo)旋(xuan)DNA暴露(lu)於(yu)堿(jian)的時(shi)間會使(shi)其(qi)不(bu)可(ke)逆(ni)變(bian)性(xing)，所產生的環(huan)狀(zhuang)卷(juan)曲DNA不(bu)能(neng)被(bei)限(xian)制酶切割(ge)，而(er)且(qie)它(ta)在(zai) 瓊(qiong)脂(zhi)糖電泳中的遷(qian)移(yi)率為正常(chang)超(chao)螺(luo)旋(xuan)DNA的2倍(bei)，難(nan)以(yi)被漠化乙錠(ding)染(ran)色(se)。從(cong)細(xi)菌(jun)中(zhong)用堿裂(lie)解(jie)法(fa)提質(zhi)粒時(shi)可能(neng)會看(kan) 到(dao)微(wei)量的這種(zhong)DNA.

• 加20mL （15mL）冰(bing)浴(yu)冷的堿(jian)裂(lie)解(jie)液(ye)III。蓋上離(li)心管蓋，輕(qing)輕(qing)地但(dan)振(zhen)蕩混(hun)勻 （此(ci)時(shi)不應(ying)再(zai)有(you)兩個液(ye)相(xiang)）。將離(li)心管在(zai)冰(bing)上放置lOmino

在放置過程中(zhong)會(hui)出現(xian)由染色(se)體DNA、高分子(zi)質(zhi)量RNA,鉀離子(zi)、SDS、蛋白質(zhi)、細(xi)胞(bao)壁(bi)復(fu)合(he)物壹起形成(cheng)的乳(ru) 白(bai)色(se)沈澱。
在(zai)堿裂(lie)解(jie)液(ye)HI中(zhong)最(zui)好(hao)使(shi)用乙酸(suan)鉀(jia)而(er)非(fei)乙酸(suan)鈉(na)，因為十二烷(wan)基(ji)乙酸(suan)鉀(jia)鹽比(bi)鈉(na)鹽(yan)難(nan)溶(rong)•
13. 4°C用(yong)＞20 000g離(li)心30min,讓轉子(zi)自動(dong)停(ting)止，無須(xu)制動(dong)。將上清輕(qing)輕(qing)移入(ru)量(liang)筒(tong)中， 棄(qi)去(qu)沈澱。
不(bu)能形成(cheng)緊(jin)密(mi)沈澱的原(yuan)因壹般是加入(ru)堿(jian)裂(lie)解(jie)液(ye)II時(shi)沒有(you)充分混(hun)勻（步(bu)驟(zhou)ID.如果細(xi)菌(jun)碎片不(bu)能(neng)形成(cheng)緊(jin)密(mi)的 沈澱，以(yi)20 OOOg再次(ci)離(li)心15min,將上清移入(ru)幹(gan)凈(jing)的離(li)心管。轉移(yi)時(shi)可用(yong)4層(ceng)紗布(bu)過濾(lv)上清，可以(yi)除(chu)去(qu)黏(nian)稠(chou)的基(ji) 因組DNA和(he)蛋白質(zhi)沈澱。
質(zhi)粒DNA回(hui)收(shou)

• 量(liang)取上清體積，將(jiang)其(qi)連同(tong)0.6倍(bei)體積的異(yi)丙醇(chun)壹起(qi)移入(ru)壹(yi)支幹凈(jing)離(li)心管中(zhong)並將(jiang)其(qi) 充(chong)分混(hun)勻，室(shi)溫下(xia)放置lOmin。

15. 在室溫下(xia)以(yi)12 OOOg離心15min回(hui)收(shou)核(he)酸沈澱。
若(ruo)在4莒離心會使(shi)鹽沈澱下(xia)來。

• 小心棄去(qu)上清，將離心管敞開蓋，倒(dao)置(zhi)於紙(zhi)巾除(chu)去(qu)殘(can)余上清。在室溫下(xia)用70%乙 醇(chun)涮(shuan)洗管壁(bi)，倒(dao)掉(diao)乙醇(chun)，並(bing)除(chu)去(qu)管(guan)壁(bi)的液(ye)滴(di)。將(jiang)離(li)心管開(kai)口(kou)倒(dao)置(zhi)於紙(zhi)巾上使(shi)剩(sheng)余乙醇(chun)揮(hui)發(fa)掉(diao)。

如果用(yong)幹(gan)燥器(qi)或(huo)者(zhe)真(zhen)空(kong)幹(gan)燥的方(fang)法(fa)幹(gan)燥DNA沈澱，在(zai)某(mou)些(xie)情況(kuang)下(xia)會使(shi)其(qi)難(nan)以(yi)溶(rong)解(jie)並(bing)可能變性(xing)（Svaren et al. 1987）.將沈澱在(zai)室溫下(xia)幹燥10~15min使(shi)乙醇(chun)揮(hui)發(fa)就足夠(gou)，不會(hui)引起(qi)DNA脫水。

• 用3mL含有2.0卩(dan)g/mL無DNA酶的RNase A的TE （pH 8.0）溶(rong)解(jie)DNA沈澱。輕(qing) 柔振(zhen)蕩溶(rong)液(ye)。將(jiang)DNA保存於-20°C O

18. 質(zhi)粒DNA的純(chun)化可(ke)用(yong)商業(ye)樹(shu)脂(zhi)進行(xing)柱(zhu)層(ceng)析（如(ru)QIAGEN公司(si)的QIA-prep）。
19. 用(yong)DNA測(ce)序及(ji)限(xian)制性(xing)酶切結(jie)合(he)凝膠(jiao)電泳分析確證質(zhi)粒結(jie)構(gou)。

疑(yi)難解(jie)答
問題(ti)（步(bu)驟19）：由(you)於(yu)質(zhi)粒毒性使(shi)質(zhi)粒DNA得(de)率低(di)（W1.0卩(dan)g/mL）。

解(jie)決方(fang)案：換(huan)成(cheng)低(di)拷(kao)貝數(shu)的質(zhi)粒或攜帶(dai)原(yuan)核(he)生物轉錄(lu)終止信(xin)號的載(zai)體。

問題(ti)（步驟(zhou)19）：在酶切前(qian)、後經(jing)電(dian)泳只見很(hen)少(shao)或無DNA。
解(jie)決方(fang)案：在(zai)乙醇(chun)沈澱後(hou)，在步(bu)驟(zhou)16中(zhong)可(ke)能將(jiang)核(he)酸丟失。離心後馬上小心地去(qu)除(chu)乙醇(chun), 如(ru)果離(li)心管放置的時(shi)間太長(chang)，DNA沈澱會(hui)與(yu)管(guan)壁(bi)分離。

問(wen)題(ti)（步驟(zhou)19）： DNA不(bu)能被限(xian)制酶切割(ge)。
解(jie)決方(fang)案：DNA不(bu)能(neng)切割(ge)，可能是沒有(you)移去(qu)所有(you)液(ye)體，在純(chun)化質(zhi)粒DNA的過(guo)程中(zhong)， 有(you)些成(cheng)分阻(zu)礙(ai)限(xian)制酶的功(gong)能(neng)。可(ke)以(yi)嘗(chang)試(shi)以(yi)下(xia)建議：

• 在步(bu)驟6中(zhong)移去(qu)所有(you)液(ye)體。

• 在步(bu)驟7中(zhong)移去(qu)所有(you)STEo

• 在(zai)步驟(zhou)16中移去(qu)所有(you)液(ye)體。

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