PCR實(shi)驗中DNA回(hui)收(shou)實驗(yan)步驟(zhou)

【實(shi)驗原(yuan)理】
1.DNA片(pian)段回收(shou)方(fang)法(fa)：DNA片(pian)段在適當濃度(du)的瓊(qiong)脂糖(tang)凝膠(jiao)中，通(tong)上(shang)壹(yi)定電(dian)壓(ya)進(jin)行(xing)電(dian)泳，不(bu)同大(da)小的DNA分(fen)子(zi)由於遷移(yi)率(lv)的不(bu)同而(er)分(fen)離(li)開。切下(xia)帶(dai)有所(suo)需DNA片(pian)段的凝(ning)膠(jiao)，用凍融(rong)法(fa)、玻璃奶(nai)回(hui)收法(fa)或商品化(hua)膠(jiao)回收試(shi)劑(ji)盒(he)將目(mu)的片(pian)段回收(shou)純(chun)化(hua)。
2.利用Taq酶能(neng)夠(gou)在PCR產(chan)物(wu)的3’末(mo)端(duan)加上(shang)壹(yi)個非模板依(yi)賴(lai)的A，而(er)T載(zai)體(ti)是(shi)壹(yi)種帶有3’T突(tu)出(chu)端的載(zai)體(ti)，在連接酶作(zuo)用下，可(ke)以(yi)把PCR產(chan)物(wu)插入到質粒載體(ti)的多(duo)克(ke)隆(long)位點，可(ke)用於PCR產(chan)物(wu)的克(ke)隆(long)和(he)測(ce)序(xu)。
　　商品化(hua)的T載(zai)體(ti)有很多(duo)。本(ben)實(shi)驗(yan)采(cai)用TaKaRa公司(si)的pMDTM18-T Simple Vector。這(zhe)個(ge)載體(ti)以(yi)pUC19載體(ti)為(wei)基(ji)礎(chu)，消除(chu)了pUC18載(zai)體(ti)上的多(duo)克(ke)隆(long)酶(mei)切(qie)位點，經EcoRⅤ酶切(qie)後(hou)在兩(liang)側的3'端(duan)添(tian)上“T"制(zhi)備(bei)而(er)成(cheng)（見(jian)附錄1）。由於本(ben)載(zai)體(ti)上消除(chu)了多(duo)克(ke)隆(long)酶(mei)切(qie)位點，克(ke)隆(long)後(hou)的PCR產(chan)物(wu)將無法(fa)使(shi)用載體(ti)上的限(xian)制(zhi)酶(mei)切下，需要(yao)在PCR擴增引物上(shang)導入合適的酶(mei)切(qie)位點。
【試(shi)劑(ji)與(yu)器材(cai)】
（壹(yi)）試(shi)劑(ji)
1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司(si)）。
2.TAE電(dian)泳緩沖(chong)液
3.瓊(qiong)脂糖(tang)（Agarose）
4.6×電(dian)泳加(jia)樣(yang)緩沖(chong)液：0.25％溴(xiu)粉藍，40％(w/v) 蔗(zhe)糖(tang)水(shui)溶(rong)液(ye)，貯存於4℃。2 / 9
5.溴(xiu)化(hua)乙錠(ding)(EB)溶(rong)液(ye)母(mu)液：配(pei)制(zhi)成(cheng)10mg/mL，用鋁箔或黑紙(zhi)包(bao)裹(guo)容(rong)器，儲(chu)於室(shi)溫(wen)即可(ke)。
6.70%乙醇(chun)
7.膠(jiao)回收試(shi)劑(ji)盒(he)（Omega公司(si)）
（二(er)）器材(cai)
　　水(shui)平(ping)式電(dian)泳裝置,電(dian)泳儀(yi),臺式高速(su)離(li)心機, 恒(heng)溫(wen)水(shui)浴(yu)鍋(guo), 微量移液槍, 微(wei)波爐(lu)或電(dian)爐(lu),紫(zi)外透(tou)射儀(yi), 凝膠(jiao)成像系統或其它(ta)照相設(she)備(bei)。
【操(cao)作方法(fa)】
　　（壹(yi)）膠(jiao)回收試(shi)劑(ji)盒(he)回收PCR產(chan)物(wu)（以(yi)Omega公司(si)Gel Extraction Kit為(wei)例(li)）
1.當目的片(pian)段DNA分離(li)時(shi)，轉(zhuan)移(yi)凝膠(jiao)至紫(zi)外燈(deng)上盡(jin)可(ke)能快地(di)切下(xia)目(mu)的片(pian)段。
2.凝膠(jiao)塊(kuai)轉(zhuan)移(yi)至1.5ml離心管(guan)(離(li)心管(guan)已(yi)經稱(cheng)重(zhong)了)中，稱(cheng)重(zhong)得出凝膠(jiao)塊(kuai)的重(zhong)量。近似地(di)確定其體(ti)積（假設其(qi)密度(du)為(wei)1g/ml）。加入等體(ti)積的Binding Buffer（XP2），於55-65℃水(shui)浴(yu)中溫(wen)浴(yu)7min或至凝(ning)膠(jiao)融(rong)化(hua)，每2-3 min振(zhen)蕩(dang)混(hun)合(he)物(wu)。（在(zai)凝膠(jiao)溶(rong)解(jie)之(zhi)後，註(zhu)意凝(ning)膠(jiao)-Binding buffer混(hun)和(he)物(wu)的pH值。如(ru)果(guo)其pH值大(da)於8的話(hua)，DNA的產(chan)量將大(da)大(da)減少(shao)。如(ru)果(guo)是(shi)橙色(se)或紅色(se)，則要(yao)加入5μl 濃度(du)為(wei)5 M，pH為(wei)5.2的醋(cu)酸(suan)鈉，以(yi)調(tiao)低其pH值。該(gai)混(hun)合(he)物(wu)的顏(yan)色將恢(hui)復為(wei)正(zheng)常的淺黃色。）
3.取壹(yi)個幹凈(jing)的HiBind DNA Mini柱(zhu)子(zi)裝在壹(yi)個幹凈的2ml收(shou)集管(guan)內(nei)（已備(bei)好）。
4.將第(di)三(san)步獲(huo)得的DNA/熔(rong)膠(jiao)液全(quan)部轉(zhuan)移(yi)至柱子(zi)中。室(shi)溫(wen)下10,000 x g離心1分鐘(zhong)。棄收集管(guan)中的濾(lv)液，將柱(zhu)子(zi)套回2ml收(shou)集管(guan)內(nei)收集管(guan)。
5.如(ru)果(guo)DNA/凝膠(jiao)熔液的體(ti)積超(chao)過700ul，壹(yi)次(ci)只能(neng)轉(zhuan)移(yi)700ul至柱子(zi)中，余(yu)下(xia)的可(ke)繼續(xu)重3 / 9
　　復第(di)5步至(zhi)所(suo)有的溶(rong)液(ye)都(dou)經過柱(zhu)子(zi)。每壹(yi)個Hibind DNA回收(shou)純(chun)化柱(zhu)都(dou)有壹(yi)個極限(xian)為(wei)25μg DNA的吸附能力(li)。如(ru)果(guo)預期產(chan)量較大(da)，則把樣(yang)品分別加(jia)到(dao)合適數目的柱(zhu)子(zi)中。
6.棄(qi)收(shou)集管(guan)中的濾(lv)液，將柱(zhu)子(zi)套回2ml收(shou)集管(guan)內(nei)收集管(guan)。轉(zhuan)移(yi)300μl Binding Buffer（XP2）至柱子(zi)中，室(shi)溫(wen)下，10,000 x g下離心1min。
7.棄收(shou)集管(guan)中的濾(lv)液，將柱(zhu)子(zi)套回2ml收(shou)集管(guan)內(nei)收集管(guan)。轉(zhuan)移(yi)700μl SPW Wash buffer（已用無水(shui)乙醇(chun)稀(xi)釋的）至(zhi)柱(zhu)子中。室(shi)溫(wen)下10,000xg離心1min。（濃縮的SPW Wash Buffer在(zai)使(shi)用之(zhi)前必(bi)須按(an)標簽的提(ti)示用乙醇(chun)稀(xi)釋。如(ru)果(guo)DNA洗滌(di)緩沖(chong)液在(zai)使(shi)用之(zhi)前是(shi)置於冰箱(xiang)中的，須將其(qi)拿(na)出(chu)置(zhi)於室(shi)溫(wen)下）。
8.重復用700μl SPW Wash buffer洗滌(di)柱(zhu)子。室(shi)溫(wen)下10,000xg離心1min。
9.棄收(shou)集管(guan)中的濾(lv)液，將柱(zhu)子(zi)套回2ml收(shou)集管(guan)內(nei)收集管(guan)。室(shi)溫(wen)下,13,000 x g離心2 min以(yi)甩幹柱子(zi)基(ji)質(zhi)殘(can)余的液(ye)體(ti)。
10.把柱(zhu)子裝在壹(yi)個幹凈的1.5ml離(li)心管(guan)上(shang)，加入15~30μl（具體(ti)取決(jue)於預期的終產(chan)物(wu)濃度(du)）的Elution Buffer(或TE緩沖(chong)液)到(dao)柱基(ji)質(zhi)上，室(shi)溫(wen)放置1min, 13,000xg離心1min以(yi)洗脫(tuo)DNA。第(di)壹(yi)次(ci)洗(xi)脫(tuo)可(ke)以(yi)洗出(chu)70-80%的結(jie)合(he)DNA。如(ru)果(guo)再洗(xi)脫(tuo)壹(yi)次(ci)的話(hua)，可(ke)以(yi)把殘(can)余的DNA洗(xi)脫(tuo)出來(lai)，不(bu)過那(na)樣(yang)的濃(nong)度(du)就會(hui)較低。
　　（二(er)）連接反(fan)應（以(yi)Takara公司(si)pMDTM18-T Simple Vector Kit為(wei)例(li)）
1）在(zai)微(wei)量離心管(guan)中配(pei)制(zhi)下(xia)列DNA溶(rong)液(ye)，全(quan)量為(wei)5 μl。
pMDTM18-T Simple Vector1 μlInsert DNA0.1 pmol～0.3 pmoldH2Oup to 5 μl4 / 9
2）加入5 μl（等量）的Solution I。
3）16℃反(fan)應30分(fen)鐘(zhong)。（2 kbp以(yi)上長(chang)片(pian)段PCR產(chan)物(wu)進(jin)行(xing)DNA克(ke)隆(long)時(shi)，連接反(fan)應時(shi)間(jian)請(qing)延(yan)長(chang)至數(shu)小時）。
4）全(quan)量（10 μl）加入至100 μl 感受(shou)態(tai)細胞中，冰中放(fang)置(zhi)30分鐘(zhong)。
5）42℃加熱45秒鐘(zhong)後，再在(zai)冰中放(fang)置(zhi)1分鐘(zhong)。
6）加入890 μl LB培養基(ji)，37℃振(zhen)蕩(dang)培(pei)養(yang)60分(fen)鐘(zhong)。
7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB瓊(qiong)脂平(ping)板培養基(ji)上(shang)培養(yang)，形成(cheng)單菌落。計(ji)數白(bai)色、藍色菌(jun)落。
8）挑(tiao)選(xuan)白(bai)色菌落，鑒(jian)定載體(ti)中插(cha)入片(pian)段的長(chang)度(du)大(da)小。
【註(zhu)意事(shi)項與提(ti)示】
1.使(shi)用新鮮(xian)的電(dian)泳緩沖(chong)液TAE Buffer。不(bu)要(yao)重復使(shi)用，其PH的升高會(hui)減少(shao)產(chan)量。
2.不(bu)論采(cai)取何(he)種(zhong)方法(fa)回(hui)收(shou)DNA，在(zai)回收過程中，要(yao)盡(jin)量減少(shao)洗(xi)脫(tuo)體(ti)積，以(yi)便提(ti)高收(shou)得率(lv)和(he)濃(nong)度(du)，以(yi)方便(bian)後續(xu)操作(zuo)。
3.從(cong)膠(jiao)上回收(shou)DNA時(shi)，應盡(jin)量縮短(duan)光(guang)照時(shi)間並采(cai)用長(chang)波長(chang)紫(zi)外燈(deng)(300-360nm)，以(yi)減少(shao)紫(zi)外光(guang)對DNA的切(qie)割(ge)。DNA曝(pu)露(lu)在紫(zi)外燈(deng)下不(bu)能超(chao)過30秒。
4.連接反(fan)應時(shi)間(jian)是(shi)與溫(wen)度(du)密切(qie)相關(guan)，因(yin)為(wei)反(fan)應速(su)度(du)隨(sui)溫(wen)度(du)的提(ti)高而(er)加(jia)快。通常可(ke)采(cai)用16℃連接4小時(shi)為(wei)宜，如(ru)是(shi)平(ping)端連接需要(yao)適當延長(chang)反(fan)應時(shi)間(jian)以(yi)提(ti)高連接效率(lv)；在選(xuan)擇(ze)反(fan)應的溫(wen)度(du)與時間關(guan)系時(shi)，也要(yao)考慮在反(fan)應系(xi)統中其(qi)他(ta)因(yin)素的影(ying)響(xiang)。
5.連接反(fan)應的整個過(guo)程(cheng)應註(zhu)意槍頭(tou)的潔(jie)凈(jing)以(yi)避免(mian)造成(cheng)對酶(mei)的汙(wu)染，為(wei)防(fang)止酶(mei)活性降(jiang)低，取酶時(shi)應在(zai)冰上(shang)操(cao)作且動作(zuo)迅速(su)。7.  
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6.連接反(fan)應應在(zai)25℃以(yi)下進(jin)行(xing)，溫(wen)度(du)升高較難(nan)形(xing)成環狀(zhuang)DNA，影響連接效率(lv)。長(chang)片(pian)段PCR產(chan)物(wu)（2kb以(yi)上）進(jin)行(xing)連接時，連接反(fan)應時(shi)間(jian)應延(yan)長(chang)至數(shu)小時。
7.進(jin)行(xing)克(ke)隆(long)時(shi)，Vector DNA和(he)Insert DNA的摩(mo)爾(er)數(shu)比壹(yi)般(ban)為(wei)1:2~10。根(gen)據實(shi)驗情況(kuang)選(xuan)擇(ze)合(he)適的摩(mo)爾(er)數(shu)比。
8.用高效(xiao)的感(gan)受(shou)態(tai)細胞（轉(zhuan)化(hua)效率(lv)≥1×108 cfu/μg pUC19），這樣(yang)才可(ke)能得到比較理想的陽(yang)性克(ke)隆(long)。
 
9.試(shi)劑(ji)盒(he)配(pei)有Control DNA。通過(guo)對照(zhao)實驗判斷(duan)試(shi)劑(ji)盒(he)的保(bao)存效(xiao)果(guo)。
【實驗(yan)安排(pai)】
　　第(di)壹(yi)天(tian)下(xia)午(wu)：配(pei)制(zhi)6×電(dian)泳加(jia)樣(yang)緩沖(chong)液、TAE等緩沖(chong)液，將各種(zhong)耗(hao)材(cai)滅菌(jun)。
　　第(di)二(er)天(tian)上(shang)午(wu)：制(zhi)備(bei)瓊脂糖(tang)凝（1%），電(dian)泳檢(jian)測(ce)，切膠(jiao)回收DNA片(pian)段
　　第(di)二(er)天(tian)下(xia)午(wu)：大(da)腸(chang)桿菌(jun)制(zhi)備(bei)感受(shou)態(tai)細胞；DNA與(yu)T載體(ti)連接轉(zhuan)化(hua)大(da)腸(chang)桿菌(jun)。
第(di)三(san)天(tian)上(shang)午(wu)：觀(guan)察轉(zhuan)化(hua)結果（藍(lan)白(bai)斑情況(kuang)），計(ji)算重(zhong)組率(lv)。
　　
 

蘇(su)州(zhou)阿爾(er)法(fa)生物提(ti)供(gong)的朗基(ji)系(xi)列PCR儀(yi)器包(bao)括：基(ji)因(yin)擴增儀，快速PCR儀，熒光(guang)定量PCR儀，雙(shuang)槽梯(ti)度(du)PCR儀，朗基(ji)PCR儀(yi)等，同時(shi)提(ti)供(gong)PCR檢(jian)測(ce)耗(hao)材(cai)、PCR試(shi)劑(ji)等。