實(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)pcr檢測(ce)DNA濃(nong)度(du)常用(yong)的(de)生(sheng)物試劑(ji)

實(shi)時(shi)熒(ying)光(guang)pcr檢測(ce)利用熒(ying)光(guang)分(fen)析法(fa)用特(te)定結(jie)合DNA的(de)染(ran)料來(lai)測(ce)定DNA的(de)濃(nong)度(du)。常用(yong)的(de)DNA染(ran)料包(bao)括(kuo) 溴化(hua)乙錠(ding)、Hoechst33258、SYBR Green I 和 II、SYBR Gold 及 PicoGreen。

 溴化(hua)乙錠(ding)
溴化(hua)乙錠(ding)含(han)有(you)三環(huan)菲嚏(ti)平(ping)面(mian)環(huan)系統(tong)，可(ke)嵌入(ru)到(dao)雙(shuang)鏈DNA堿基之間(jian)。嵌入DNA雙螺旋 後(hou)，溴化(hua)乙錠(ding)的(de)菲嚏(ti)環(huan)平面(mian)位(wei)於與(yu)螺旋軸相垂直的位(wei)置，並通(tong)過範德瓦耳(er)斯力(li)與(yu)上下(xia)堿(jian)基 結(jie)合。而其(qi)平面(mian)環(huan)系統(tong)被(bei)埋在(zai)底(di)部，其外(wai)側(ce)的苯(ben)基和乙烷(wan)基處(chu)於(yu)DNA雙(shuang)螺旋的大(da)溝內(nei)。 在(zai)高強度(du)離子溶(rong)液的(de)飽和狀態，大(da)約每(mei)2.5個(ge)堿(jian)基對(dui)嵌入(ru)壹分(fen)子的(de)溴化(hua)乙錠(ding)，這(zhe)與(yu)DNA的 堿(jian)基組成無(wu)關。溴化(hua)乙錠(ding)的(de)嵌(qian)入壹般(ban)不(bu)會(hui)對(dui)堿基對(dui)的構象(xiang)及(ji)其(qi)在(zai)螺旋中(zhong)的位(wei)置產生(sheng)影(ying)響， 除了(le)會(hui)使堿基對(dui)沿螺旋軸移位(wei)3.4A (Waring 1965)。這種(zhong)移位(wei)可(ke)造成(cheng)飽(bao)和溴化(hua)乙錠(ding)的(de)DNA 分(fen)子長(chang)度(du)增(zeng)加(jia) 27% 。
溴化(hua)乙錠(ding)還(hai)可(ke)以高度(du)可(ke)變計(ji)量學(xue)與(yu)RNA和熱(re)變性(xing)或(huo)單(dan)鏈DNA形成的(de)鏈(lian)間(jian)堿基對(dui)結(jie)合 (Waring 1965, 1966； Lepecq and Paoletti 1967)»溴化(hua)乙錠(ding)平(ping)面(mian)基團(tuan)的固(gu)定位(wei)置及其(qi)與(yu)堿 基的密切接近(jin)可(ke)使結(jie)合的(de)染(ran)料散(san)發的熒(ying)光(guang)比(bi)遊(you)離(li)在(zai)溶(rong)液中(zhong)的染(ran)料要(yao)強(qiang)20-25倍O 254nm的 紫外(wai)線(xian)(UV)照射由(you)DNA吸(xi)收(shou)，並轉移至(zhi)溴化(hua)乙錠(ding)；302nm和366nm的紫外(wai)線(xian)照射由(you)溴 化(hua)乙錠(ding)本身吸(xi)收(shou)。在(zai)590nm和可(ke)見(jian)光(guang)的(de)紅-黃(huang)區壹小部(bu)分(fen)(約0.3)可(ke)被(bei)重(zhong)新釋(shi)放(fang)出(chu)來(lai)(Lepecq and Paoletti 1967 ； Tuma et al. 1999)»
大(da)多數(shu)銷售的(de)UV光(guang)源可(ke)發射302nm的UV光(guang)。溴化(hua)乙錠(ding)-DNA復(fu)合物在(zai)此(ci)波(bo)長(chang)產(chan)生(sheng) 的(de)熒(ying)光(guang)明(ming)顯(xian)強於(yu)366nm，但(dan)略(lve)微(wei)低於(yu)較短(duan)的波長(chang)(254nm)。然而，DNA分(fen)子的(de)光(guang)漂白和 斷裂(lie)作用在(zai)302nm要(yao)比(bi)在(zai)254nm處(chu)低(di)得(de)多(duo)。
溴化(hua)乙錠(ding)主(zhu)要(yao)用(yong)於檢測(ce)瓊(qiong)脂糖中(zhong)的DNA,但(dan) 這(zhe)種(zhong)染(ran)料也還(hai)可(ke)以用(yong)於(yu)半定量地(di)估(gu)算(suan)DNA溶(rong)液的(de)濃度(du)。
▲在(zai)酵母及沙(sha)門(men)氏(shi)菌中(zhong)，溴化(hua)乙錠(ding)本身並(bing)不(bu)容(rong)易誘發突(tu)變，但(dan)它(ta)通過微粒體酶(mei)代謝(xie)的(de)化(hua)合物可(ke)中(zhong)度(du)誘變，多(duo)數(shu)研究(jiu)所開(kai)發了(le)安(an)全(quan)操(cao)作及處(chu)理含有(you) 溴化(hua)乙錠(ding)溶(rong)液及(ji)膠的(de)說明(ming)。研究(jiu)者(zhe)應該根據這些說明(ming)來處(chu)理溴化(hua)乙錠(ding)。安(an)全(quan)處(chu)理溴化(hua)乙錠(ding)的(de)試劑(ji)盒也可(ke)通過Schleicher & Schuell和Qbiogene 公(gong)司及其(qi)他(ta)渠道(dao)獲(huo)得。
Hoechst 33258
Hoechst 33258是壹類(lei)雙-苯(ben)並咪哩熒(ying)光(guang)染(ran)料，可(ke)高特異(yi)性(xing)非插入地(di)結(jie)合於(yu)DNA雙(shuang)鏈的(de) 小溝。結(jie)合的(de)染(ran)料產(chan)生(sheng)的(de)熒(ying)光(guang)從(cong)0.01 ±升到(dao)0.6 ,因(yin)此(ci)，Hoechst 33258用(yong)於(yu)雙(shuang)鏈(lian)DNA溶(rong)液的(de)熒(ying)光(guang)檢測(ce)及(ji)定量。Hoechst 33258比(bi)溴化(hua)乙錠(ding)更優(you)先(xian)使用，因 為它(ta)具有(you)非常(chang)強(qiang)的區(qu)分(fen)雙鏈(lian)DNA與RNA及(ji)單(dan)鏈DNA的能力(li)。
與(yu)其他(ta)非嵌(qian)入(ru)染(ran)料類(lei)似, Hoechst 33258可(ke)優(you)先(xian)結(jie)合DNA螺 旋中(zhong)的富(fu)含(han)A/TK(Weisblum and Haenssler 1974),並隨著A+T含(han)量的(de)增(zeng)加(jia)，熒(ying)光(guang)強(qiang)度(du)以 10的(de)對(dui)數增(zeng)長(chang)= Hoechst 33258與(yu)雙(shuang)鏈(lian)DNA結(jie)合產(chan)生(sheng)的(de)熒(ying)光(guang)比(bi)與(yu)單(dan) 鏈DNA結(jie)合要(yao)強(qiang)3倍左(zuo)右(you)。
SYBR Green I
SYBR Green I (Life Technologies)是壹種(zhong)嵌(qian)入(ru)型(xing)青藍色染(ran)料，在(zai)488nm藍色(se)光(guang)照(zhao)射激 發(fa)後(hou)，在(zai)522nm (綠(lv)光(guang))具(ju)有(you)發(fa)射高峰(feng)。盡管(guan)SYBR Green I可(ke)加(jia)入(ru)到(dao)凝(ning)膠上樣緩沖(chong)液中(zhong)， 但(dan)並(bing)不(bu)推(tui)薦這樣使用，因為該染(ran)料對(dui)DNA在(zai)凝膠(jiao)中(zhong)的遷(qian)移影(ying)響很(hen)大(da)。為得(de)到(dao)好(hao)的(de)效(xiao)果(guo)， 凝膠應該進(jin)行(xing)預(yu)染(ran)處(chu)理。由(you)於(yu)產生(sheng)的(de)熒(ying)光(guang)很(hen)強，SYBR Green I是壹種(zhong)可(ke)用於(yu)檢測(ce)少量DNA
(低(di)拷(kao)貝/PCR產(chan)物數量少)的理想染(ran)料。少至(zhi)20pg的(de)DNA或(huo)250pg多(duo)分(fen)散性(xing)DNA在(zai)經 過SYBR Green I染(ran)色後(hou)，凝(ning)膠(jiao)可(ke)用基於CCD的圖像(xiang)記錄系統(tong)進(jin)行(xing)檢測(ce)。
因(yin)為SYBR染(ran)料-DNA復(fu)合物在(zai)非極(ji)性(xing)溶(rong)液中(zhong)可(ke)解離，因(yin)此(ci)可(ke)用乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)的(de)方法(fa)將(jiang) SYBR Green I 從(cong) DNA 中(zhong)去除(chu)。
SYBR Green II
SYBR Green II (Life Technologies)主(zhu)要(yao)用(yong)於對(dui)電泳後(hou)的(de)RNA和單(dan)鏈DNA進(jin)行(xing)染(ran)色。 由(you)於(yu)該染(ran)料在(zai)結(jie)合RNA後(hou)發(fa)出(chu)非常(chang)亮(liang)的熒(ying)光(guang)及(ji)其在(zai)凝膠(jiao)中(zhong)的低(di)背景，SYBR Green II經常 用(yong)來(lai)對(dui)多聚甲醛/瓊(qiong)脂糖或聚丙(bing)烯(xi)酰(xian)胺(an)凝膠(jiao)中(zhong)的RNA進(jin)行(xing)染(ran)色。
利用肝(gan)臟(zang)提取物進(jin)行(xing)Ames實驗顯(xian)示SYBR染(ran)料與(yu)溴化(hua)乙錠(ding)相比(bi)致(zhi)癌(ai)性(xing)要(yao)低(di)(Singer et aL 1999)。但(dan)SYBR Green在(zai)暴露(lu)於UV的(de)細菌中(zhong)比(bi)溴化(hua)乙錠(ding)更容(rong)易(yi)誘發(fa)突變(Ohta et al. 2001 )o Life Technologies公(gong)司現(xian)在(zai)銷售更安(an)全(quan)的SYBR染(ran)料(SYBR-Safe DNA凝(ning)膠染(ran)色) (見(jian) Martineau et al. 2008)。
SYBR Gold
SYBR Gold (Life Technologies)是檢測(ce)凝(ning)膠中(zhong)DNA和RNA高度(du)靈敏(min)的(de)染(ran)料，與(yu)300nm 紫外(wai)光(guang)源和基於CCD的圖像(xiang)記錄系統(tong)聯合使用。結(jie)合DNA後(hou)，SYBR Gold在(zai)495nm和 300nm處(chu)均(jun)有(you)大(da)激發(fa)(發(fa)射波長(chang)可(ke)達(da)537nm)。
結(jie)合核(he)酸(suan)後(hou)，SYBR Gold的(de)熒(ying)光(guang)增(zeng)強(qiang)程(cheng)度(du)是溴化(hua)乙錠(ding)的(de)30多(duo)倍。SYBR Gold染(ran)凝膠 中(zhong)DNA的靈(ling)敏度(du)是SYBR Green I的(de)10多(duo)倍，染(ran)乙醛酸(suan)化的(de)RNA的靈敏度(du)是溴化(hua)乙錠(ding)的(de) 25倍(bei)以上。
SYBR Glod也可(ke)用於(yu)檢測(ce)甲基敏感(gan)的(de)單(dan)鏈構象(xiang)分(fen)析(MS-SSCA) (McKee and Thomson 2004)0然而，由(you)於(yu)其成本較高，SYBR Gold並不(bu)是檢測(ce)凝(ning)膠中(zhong)DNA或DNA定量的(de)常(chang)規(gui) 選擇染(ran)料。Ames實(shi)驗顯(xian)示SYBR Gold並(bing)不(bu)具(ju)有(you)誘(you)變作用(Kirsanov et al. 2010),並(bing)且(qie)不(bu)像(xiang) 其(qi)他(ta)菲嚏(ti)類(lei)染(ran)料如(ru)溴化(hua)乙錠(ding)，SYBR Gold可(ke)很(hen)容易地(di)通(tong)過乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)法(fa)從DNA中(zhong)去除(chu)。
PicoGreen
PicoGreen (Life Technologies)是壹種(zhong)耐(nai)光(guang)性(xing)染(ran)料，在(zai)480nm處(chu)有(you)*大(da)激發(fa)，在(zai)520nm 處(chu)有(you)發(fa)射高峰(feng)，可(ke)特異(yi)結(jie)合雙(shuang)鏈(lian)DNA。在(zai)檢測(ce)溶(rong)液中(zhong)雙鏈(lian)DNA時(shi)，其具(ju)有(you)高靈敏(min)度(du)和 大(da)動(dong)力性(xing)範(fan)圍(wei)。PicoGreen廣(guang)泛(fan)應用於(yu)多孔(kong)板DNA樣品的自動(dong)化檢測(ce)和定量。利用壹個(ge) 染(ran)料濃(nong)度(du)，可(ke)檢測(ce)1〜1000ng/mL的(de)DNA樣品，並可(ke)通過手持型熒(ying)光(guang)分(fen)析儀(yi)進(jin)行(xing)精(jing)確(que)定量 。
將(jiang)染(ran)料從(cong)DNA中(zhong)去除(chu)
在(zai)推(tui)薦使用濃度(du)範圍(wei)內(nei)，SYBRGreen I和SYBR Gold並不(bu)顯(xian)著抑制限(xian)制(zhi)酶(mei)、連接酶(mei)及 熱(re)穩(wen)定DNA聚合酶(mei)的活性(xing)。這(zhe)些(xie)染(ran)料不(bu)像(xiang)溴化(hua)乙錠(ding)和其他(ta)菲嚏(ti)類(lei)染(ran)料，可(ke)非常(chang)容(rong)易通(tong)過 乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)法(fa)從DNA中(zhong)去除(chu)。
  溴化(hua)乙錠(ding)染(ran)DNA後(hou)可(ke)抑制後(hou)續(xu)酶(mei)促(cu)反(fan)應中(zhong)DNA作為模(mo)板(ban)或(huo)底(di)物的能力(li)。幸(xing)運的是， 溴化(hua)乙錠(ding)可(ke)通過兩(liang)次等體(ti)積(ji)的異丙(bing)醇(chun)或酚(fen)：氯(lv)仿(fang)(25 : 1)萃取，非常(chang)容(rong)易並(bing)快(kuai)速(su)地從DNA 中(zhong)去除(chu)。去染(ran)色的DNA可(ke)再通(tong)過乙醇(chun)沈(chen)澱(dian)回(hui)收(shou)。
   實際(ji)上，所(suo)有(you)用(yong)於(yu)純化(hua)DNA的(de)商(shang)業試劑(ji)盒或系(xi)統(tong)都可(ke)有(you)效(xiao)地(di)將溴化(hua)乙錠(ding)及(ji)其(qi)他(ta)DNA 結(jie)合染(ran)料從(cong)DNA中(zhong)去除(chu)。

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