PCR產(chan)物(wu)的(de)克隆-DNA回(hui)收實(shi)驗步(bu)驟(zhou)

PCR產(chan)物(wu)的(de)克隆-DNA回(hui)收實(shi)驗步(bu)驟(zhou)

【實驗(yan)原(yuan)理(li)】

1.DNA片段回(hui)收方法(fa)：DNA片段在適(shi)當濃(nong)度(du)的(de)瓊(qiong)脂糖(tang)凝(ning)膠中，通(tong)上(shang)壹定電壓(ya)進行電泳，不(bu)同大小的(de)DNA分子由(you)於遷(qian)移(yi)率的(de)不(bu)同而(er)分離(li)開(kai)。切(qie)下(xia)帶有所(suo)需DNA片段的(de)凝(ning)膠，用凍(dong)融法(fa)、玻璃(li)奶(nai)回(hui)收法(fa)或(huo)商品化(hua)膠回(hui)收試(shi)劑盒將目的(de)片段回(hui)收純(chun)化(hua)。

2.利用(yong)Taq酶能(neng)夠在PCR產(chan)物(wu)的(de)3’末(mo)端加上(shang)壹個(ge)非(fei)模(mo)板(ban)依(yi)賴的(de)A，而(er)T載(zai)體(ti)是壹種(zhong)帶有3’T突(tu)出(chu)端的(de)載(zai)體(ti)，在連(lian)接(jie)酶作(zuo)用下(xia)，可以把PCR產(chan)物(wu)插入(ru)到質(zhi)粒(li)載(zai)體(ti)的(de)多(duo)克隆位點，可(ke)用(yong)於PCR產(chan)物(wu)的(de)克隆和測(ce)序。

　　商品化(hua)的(de)T載(zai)體(ti)有很(hen)多(duo)。本(ben)實驗采用TaKaRa公司(si)的(de)pMDTM18-T Simple Vector。這(zhe)個(ge)載(zai)體(ti)以(yi)pUC19載(zai)體(ti)為基礎(chu)，消(xiao)除(chu)了(le)pUC18載(zai)體(ti)上(shang)的(de)多(duo)克隆酶切(qie)位(wei)點，經(jing)EcoRⅤ酶切(qie)後在兩(liang)側的(de)3'端添(tian)上(shang)“T"制(zhi)備而(er)成（見附(fu)錄(lu)1）。由(you)於本(ben)載(zai)體(ti)上(shang)消除(chu)了(le)多克隆酶切(qie)位(wei)點，克隆後的(de)PCR產(chan)物(wu)將無(wu)法(fa)使用(yong)載(zai)體(ti)上(shang)的(de)限(xian)制(zhi)酶切(qie)下(xia)，需要(yao)在PCR擴(kuo)增引物(wu)上(shang)導入(ru)合適(shi)的(de)酶切(qie)位(wei)點。

【試(shi)劑(ji)與器材】

（壹(yi)）試(shi)劑(ji)

1.pMDTM18-T Simple Vector Kit（Takara公司(si)）。

2.TAE電泳緩沖液

3.瓊(qiong)脂糖(tang)（Agarose）

4.6×電泳加(jia)樣緩沖液：0.25％溴粉(fen)藍(lan)，40％(w/v) 蔗糖水(shui)溶(rong)液，貯(zhu)存(cun)於4℃。2 / 9

5.溴化(hua)乙(yi)錠(ding)(EB)溶(rong)液母(mu)液：配(pei)制(zhi)成10mg/mL，用鋁(lv)箔(bo)或(huo)黑(hei)紙包(bao)裹容器，儲於室溫即可。

6.70%乙(yi)醇(chun)

7.膠回(hui)收試(shi)劑盒（Omega公司(si)）

（二）器材

　　水(shui)平式(shi)電泳裝置,電泳儀(yi),臺式(shi)高速離(li)心(xin)機(ji), 恒(heng)溫水(shui)浴鍋(guo), 微量移(yi)液槍(qiang), 微(wei)波(bo)爐(lu)或(huo)電爐(lu),紫外透(tou)射儀(yi), 凝(ning)膠成像系(xi)統或(huo)其它照相設備。

【操(cao)作(zuo)方法(fa)】

　　（壹）膠回(hui)收試(shi)劑盒回(hui)收PCR產(chan)物(wu)（以Omega公司(si)Gel Extraction Kit為例）

1.當目的(de)片段DNA分離(li)時，轉移(yi)凝(ning)膠至紫外燈(deng)上(shang)盡(jin)可能(neng)快地(di)切(qie)下(xia)目的(de)片段。

2.凝(ning)膠塊轉(zhuan)移(yi)至1.5ml離(li)心(xin)管(離(li)心(xin)管已(yi)經(jing)稱重(zhong)了(le))中，稱重(zhong)得(de)出(chu)凝(ning)膠塊的(de)重(zhong)量。近似地確(que)定其體(ti)積(ji)（假(jia)設其(qi)密(mi)度(du)為1g/ml）。加入(ru)等(deng)體(ti)積(ji)的(de)Binding Buffer（XP2），於55-65℃水(shui)浴中(zhong)溫浴7min或(huo)至凝(ning)膠融化(hua)，每(mei)2-3 min振(zhen)蕩(dang)混(hun)合物。（在凝(ning)膠溶(rong)解(jie)之(zhi)後，註意凝(ning)膠-Binding buffer混(hun)和物的(de)pH值。如(ru)果(guo)其pH值大(da)於8的(de)話(hua)，DNA的(de)產(chan)量將大大(da)減少。如(ru)果(guo)是橙色(se)或(huo)紅色(se)，則要(yao)加入(ru)5μl 濃(nong)度(du)為5 M，pH為5.2的(de)醋(cu)酸鈉(na)，以調(tiao)低其pH值。該(gai)混(hun)合物的(de)顏(yan)色(se)將恢復為正常(chang)的(de)淺(qian)黃(huang)色(se)

3.取(qu)壹個(ge)幹凈的(de)HiBind DNA Mini柱(zhu)子裝在壹(yi)個(ge)幹凈(凈)的(de)2ml收(shou)集(ji)管內（已備好(hao)）。

4.將第三(san)步(bu)獲(huo)得(de)的(de)DNA/熔膠液全(quan)部轉(zhuan)移(yi)至柱(zhu)子中(zhong)。室溫下10,000 x g離(li)心(xin)1分鐘(zhong)。棄(qi)收集(ji)管中(zhong)的(de)濾液，將柱(zhu)子套(tao)回(hui)2ml收集(ji)管內收集(ji)管。

5.如(ru)果(guo)DNA/凝(ning)膠熔液的(de)體(ti)積(ji)超過(guo)700ul，壹次(ci)只能(neng)轉移(yi)700ul至柱(zhu)子中(zhong)，余下(xia)的(de)可(ke)繼(ji)續(xu)重(zhong)3 / 9

　　復(fu)第5步(bu)至(zhi)所(suo)有的(de)溶(rong)液都經(jing)過(guo)柱(zhu)子。每(mei)壹(yi)個(ge)Hibind DNA回(hui)收純(chun)化(hua)柱(zhu)都有壹(yi)個(ge)極(ji)限(xian)為25μg DNA的(de)吸(xi)附(fu)能(neng)力。如(ru)果(guo)預期產(chan)量較大(da)，則把(ba)樣品分別加(jia)到合適(shi)數(shu)目的(de)柱(zhu)子中(zhong)。

6.棄(qi)收集(ji)管中(zhong)的(de)濾液，將柱(zhu)子套(tao)回(hui)2ml收集(ji)管內收集(ji)管。轉(zhuan)移(yi)300μl Binding Buffer（XP2）至柱(zhu)子中(zhong)，室溫下，10,000 x g下離(li)心(xin)1min。

7.棄(qi)收集(ji)管中(zhong)的(de)濾液，將柱(zhu)子套(tao)回(hui)2ml收集(ji)管內收集(ji)管。轉(zhuan)移(yi)700μl SPW Wash buffer（已用(yong)無(wu)水(shui)乙(yi)醇(chun)稀釋(shi)的(de)）至(zhi)柱(zhu)子中(zhong)。室溫下10,000xg離(li)心(xin)1min。（濃(nong)縮(suo)的(de)SPW Wash Buffer在使(shi)用(yong)之(zhi)前(qian)必須按(an)標(biao)簽的(de)提(ti)示用(yong)乙(yi)醇(chun)稀釋(shi)。如(ru)果(guo)DNA洗滌(di)緩沖液在使(shi)用(yong)之(zhi)前(qian)是置於冰箱(xiang)中的(de)，須將其拿(na)出(chu)置於室溫下）。

8.重(zhong)復(fu)用700μl SPW Wash buffer洗滌(di)柱(zhu)子。室溫下10,000xg離(li)心(xin)1min。

9.棄(qi)收集(ji)管中(zhong)的(de)濾液，將柱(zhu)子套(tao)回(hui)2ml收集(ji)管內收集(ji)管。室溫下,13,000 x g離(li)心(xin)2 min以(yi)甩(shuai)幹柱(zhu)子基(ji)質(zhi)殘余的(de)液體(ti)。

10.把(ba)柱(zhu)子裝在壹(yi)個(ge)幹凈(凈)的(de)1.5ml離(li)心(xin)管上(shang)，加入(ru)15~30μl（具(ju)體(ti)取(qu)決於預期的(de)終產(chan)物(wu)濃度(du)）的(de)Elution Buffer(或(huo)TE緩沖液)到柱(zhu)基(ji)質(zhi)上(shang)，室溫放置1min, 13,000xg離(li)心(xin)1min以(yi)洗脫(tuo)DNA。第壹(yi)次洗脫(tuo)可以(yi)洗出(chu)70-80%的(de)結(jie)合DNA。如(ru)果(guo)再洗脫(tuo)壹次(ci)的(de)話(hua)，可(ke)以(yi)把殘余的(de)DNA洗脫(tuo)出(chu)來(lai)，不(bu)過(guo)那(na)樣的(de)濃(nong)度(du)就(jiu)會較低。

　　（二）連(lian)接(jie)反應(ying)（以Takara公司(si)pMDTM18-T Simple Vector Kit為例）

1）在微(wei)量離(li)心(xin)管中(zhong)配(pei)制(zhi)下(xia)列(lie)DNA溶(rong)液，全(quan)量為5 μl。

pMDTM18-T Simple Vector1 μlInsert DNA0.1 pmol～0.3 pmoldH2Oup to 5 μl4 / 9

2）加入(ru)5 μl（等(deng)量）的(de)Solution I。

3）16℃反應(ying)30分鐘(zhong)。（2 kbp以(yi)上(shang)長片段PCR產(chan)物(wu)進行DNA克隆時，連(lian)接(jie)反應(ying)時間請(qing)延長(chang)至(zhi)數(shu)小(xiao)時）。

4）全(quan)量（10 μl）加入(ru)至(zhi)100 μl 感(gan)受(shou)態(tai)細(xi)胞(bao)中(zhong)，冰(bing)中(zhong)放置30分鐘(zhong)。

5）42℃加(jia)熱45秒(miao)鐘(zhong)後，再在冰(bing)中(zhong)放置1分鐘(zhong)。

6）加(jia)入(ru)890 μl LB培養基(ji)，37℃振(zhen)蕩(dang)培養60分鐘(zhong)。

7）在含(han)有X-Gal、IPTG、Amp的(de)LB瓊(qiong)脂平板(ban)培養基(ji)上(shang)培養，形成單菌(jun)落。計數(shu)白色(se)、藍(lan)色(se)菌(jun)落。

8）挑(tiao)選白色(se)菌(jun)落，鑒定載(zai)體(ti)中(zhong)插入(ru)片段的(de)長(chang)度(du)大小。

【註意事(shi)項(xiang)與提(ti)示】

1.使(shi)用(yong)新鮮的(de)電泳緩沖液TAE Buffer。不(bu)要(yao)重(zhong)復(fu)使用，其(qi)PH的(de)升(sheng)高會減少產(chan)量。

2.不論(lun)采取何(he)種(zhong)方法(fa)回(hui)收DNA，在回(hui)收過(guo)程(cheng)中，要(yao)盡(jin)量減少洗脫(tuo)體(ti)積(ji)，以便提高收得(de)率和濃度(du)，以方便(bian)後續(xu)操(cao)作(zuo)。

3.從膠上(shang)回(hui)收DNA時，應(ying)盡(jin)量縮短(duan)光(guang)照時間並采用長(chang)波(bo)長(chang)紫外燈(deng)(300-360nm)，以減少紫外光(guang)對(dui)DNA的(de)切(qie)割(ge)。DNA曝露在紫外燈(deng)下不能(neng)超過(guo)30秒(miao)。

4.連(lian)接(jie)反應(ying)時間是與溫度(du)密(mi)切(qie)相(xiang)關(guan)，因(yin)為反應(ying)速度(du)隨溫度(du)的(de)提(ti)高而(er)加快(kuai)。通常(chang)可采用16℃連(lian)接(jie)4小時為宜，如(ru)是平端連(lian)接(jie)需要(yao)適(shi)當延(yan)長(chang)反應(ying)時間以提高連(lian)接(jie)效率；在選(xuan)擇反應(ying)的(de)溫度(du)與時間關(guan)系(xi)時，也要(yao)考慮在反應(ying)系統中其(qi)他因(yin)素的(de)影響。

5.連(lian)接(jie)反應(ying)的(de)整(zheng)個(ge)過(guo)程(cheng)應(ying)註意槍(qiang)頭(tou)的(de)潔(jie)凈(jing)以(yi)避免造(zao)成對(dui)酶的(de)汙(wu)染，為防止(zhi)酶活(huo)性(xing)降低，取酶時應(ying)在冰(bing)上(shang)操作(zuo)且動(dong)作(zuo)迅速(su)。

6.連(lian)接(jie)反應(ying)應(ying)在25℃以(yi)下(xia)進行，溫度(du)升(sheng)高較難(nan)形成環(huan)狀(zhuang)DNA，影響連(lian)接(jie)效率。長片段PCR產(chan)物(wu)（2kb以上(shang)）進行連(lian)接(jie)時，連(lian)接(jie)反應(ying)時間應(ying)延長(chang)至(zhi)數(shu)小(xiao)時。

7.進行克隆時，Vector DNA和Insert DNA的(de)摩(mo)爾(er)數(shu)比(bi)壹(yi)般(ban)為1:2~10。根據(ju)實(shi)驗(yan)情(qing)況選擇合適(shi)的(de)摩(mo)爾(er)數(shu)比(bi)。

8.用(yong)高效的(de)感(gan)受(shou)態(tai)細(xi)胞(bao)（轉(zhuan)化(hua)效率≥1×108 cfu/μg pUC19），這樣(yang)才可(ke)能(neng)得到比(bi)較(jiao)理(li)想(xiang)的(de)陽(yang)性(xing)克隆。

9.試劑(ji)盒配(pei)有Control DNA。通(tong)過(guo)對(dui)照實驗判(pan)斷(duan)試劑(ji)盒的(de)保(bao)存(cun)效果(guo)。

【實驗安(an)排(pai)】

　　第壹(yi)天(tian)下(xia)午：配(pei)制(zhi)6×電泳加(jia)樣緩沖液、TAE等(deng)緩沖液，將各(ge)種(zhong)耗材滅菌。

　　第(di)二天(tian)上(shang)午：制(zhi)備瓊(qiong)脂糖(tang)凝(ning)（1%），電泳檢(jian)測(ce)，切(qie)膠回(hui)收DNA片段

　　第二天(tian)下(xia)午：大(da)腸桿菌制(zhi)備感(gan)受(shou)態細(xi)胞(bao)；DNA與(yu)T載(zai)體(ti)連(lian)接(jie)轉化(hua)大腸桿菌。

第(di)三天(tian)上(shang)午：觀(guan)察(cha)轉化(hua)結果(guo)（藍(lan)白斑情況），計算重(zhong)組(zu)率。