熒光定(ding)量pcr常見問(wen)題(ti)的可(ke)能(neng)原(yuan)因(yin)與解決(jue)方(fang)案

　　熒光定(ding)量pcr常見問(wen)題(ti)的可(ke)能(neng)原(yuan)因(yin)與解決(jue)方(fang)案

　　無Ct值或Ct值延遲出現(xian):擴增(zeng)曲線信號(hao)不佳(jia)，曲線(xian)不(bu)平(ping)滑(hua):標(biao)準曲線線性(xing)差。

　　1.擴增(zeng)產(chan)物大小(xiao)不(bu)合適：實時(shi)熒光定(ding)量PCR擴增(zeng)片(pian)段(duan)的長度通常在80-150 bp之(zhi)間(jian)，如(ru)果(guo)調整反(fan)應(ying)的時(shi)間(jian)有(you)可(ke)能(neng)擴增(zeng)500bp的片(pian)段(duan)。

　　2.PCR反應(ying)過(guo)程(cheng)中(zhong)退(tui)火(huo)及(ji)延伸的(de)時間(jian)過(guo)短或(huo)過(guo)長：應(ying)根(gen)據擴增(zeng)片(pian)段(duan)的大(da)小(xiao)予與調整。

　　3.MgCl,濃(nong)度(du)不(bu)合適：按0. 5mm的間(jian)距(ju)調整MgCI2的(de)濃(nong)度(du)。

　　4.循(xun)環數設(she)置(zhi)不足：最少(shao)設(she)置(zhi)35個循(xun)環，可(ke)以增(zeng)加到45個循(xun)環。超過(guo)45個(ge)循(xun)環以上背(bei)景(jing)信號(hao)會增(zeng)加，對實驗結(jie)果(guo)的(de)分(fen)析造成(cheng)幹擾(rao)。

　　5.在(zai)錯(cuo)誤(wu)的(de)PCR反(fan)應(ying)步(bu)驟(zhou)采(cai)集(ji)信號(hao)：應(ying)檢查(zha)程(cheng)序(xu)設(she)置(zhi)確保(bao)信號(hao)的采(cai)集(ji)是(shi)在退(tui)火(huo)的(de)步(bu)驟(zhou)進行的。

　　6.加(jia)樣的(de)誤(wu)差及(ji)錯(cuo)誤(wu)：註(zhu)意(yi)每(mei)次加(jia)樣的壹致性(xing)及(ji)移液(ye)器(qi)的校正。

　　7.DNA模板(ban)的(de)起始濃(nong)度(du)過(guo)低，不能(neng)被(bei)檢測(ce)出來：如(ru)果(guo)模(mo)板(ban)的(de)濃(nong)度(du)未(wei)知，最初的實(shi)驗(yan)可(ke)以采(cai)用(yong)較(jiao)高(gao)濃(nong)度(du)的(de)模(mo)板(ban)並(bing)進行梯度(du)稀釋(shi)。最高(gao)的(de)模板(ban)濃(nong)度(du)不(bu)超(chao)過(guo)500ng基(ji)因(yin)組(zu)DNA。

　　8.模(mo)板(ban)DNA的(de)降解：使用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電(dian)泳檢測(ce)DNA模板(ban)是(shi)否(fou)降(jiang)解，檢查(zha)DNA模(mo)板(ban)的(de)儲(chu)存條(tiao)件是(shi)否(fou)合適，如(ru)果(guo)確認(ren)降解應(ying)重新(xin)制備(bei)新(xin)鮮的(de)DNA模(mo)板(ban)。

　　9.梯(ti)度稀釋(shi)標準樣品的方(fang)法不(bu)規範(fan):應(ying)註(zhu)意(yi)梯(ti)度稀釋(shi)樣品(pin)的(de)操(cao)作(zuo)規範(fan)，準確。

　　10.引(yin)物或探(tan)針(zhen)設(she)計有誤(wu)，存在(zai)二(er)級(ji)結(jie)構：通過(guo)瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)凝(ning)膠電(dian)泳檢測(ce)熒光定(ding)量PCR反(fan)應(ying)結果(guo)，是(shi)否(fou)有(you)PCR產(chan)物存在(zai)。如(ru)果(guo)沒有PCR擴增(zeng)產(chan)品，應(ying)使用(yong)引物設(she)計軟件檢查(zha)引(yin)物的各種(zhong)指標是(shi)否(fou)合適: Tm. 與模(mo)板(ban)的(de)批配度(du)、 二級結(jie)構、擴增(zeng)片(pian)段(duan)的長度、非(fei)特異(yi)型擴增(zeng)的情(qing)況。具體的(de)數(shu)據請翻閱前面(mian)的相(xiang)關原(yuan)理說(shuo)明

　　11.引(yin)物之(zhi)間(jian)的(de)Tm值相(xiang)差過(guo)多(duo)：上下(xia)遊(you)引(yin)物的Tm值差不應(ying)超過(guo)4C。

　　12.引(yin)物或探(tan)針(zhen)的(de)使用濃(nong)度(du)不(bu)合適：應(ying)將(jiang)濃(nong)度(du)控(kong)制(zhi)在(zai)50- 900 nM之(zhi)間(jian)，探(tan)針的濃(nong)度(du)低於引(yin)物的濃(nong)度(du)。

　　13.引(yin)物或探(tan)針(zhen)降(jiang)解：使用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電(dian)泳檢測(ce)DNA模板(ban)是(shi)否(fou)降(jiang)解，檢查(zha)DNA模(mo)板(ban)的(de)儲(chu)存條(tiao)件是(shi)否(fou)合適，如(ru)果(guo)確認(ren)降解應(ying)重新(xin)制備(bei)新(xin)鮮的(de)DNA模(mo)板(ban)。

　　14.探(tan)針設(she)計的位(wei)置(zhi)在擴增(zeng)片(pian)段(duan)的5’端(duan)：應(ying)將(jiang)探針設(she)計的位(wei)置(zhi)靠(kao)近擴增(zeng)片(pian)段(duan)的3”端(duan)

　　15.探針被氧化(hua)：避(bi)免(mian)用(yong)酸性(xing)溶(rong)液溶解探針(zhen)，否(fou)則會產(chan)生(sheng)高(gao)背(bei)景(jing)熒光信號(hao)及(ji)低的擴增(zeng)信號(hao)。推(tui)薦(jian)的(de)緩(huan)沖液是(shi)pH8.0的TE緩(huan)沖液中。