蛋白質印(yin)跡技術(shu)（Western Blot）的基(ji)本(ben)流(liu)程和步驟(zhou)

蛋白質印(yin)跡技術(shu)（Western Blot）的基(ji)本(ben)流(liu)程和步驟(zhou)

本(ben)文摘(zhai)要
蛋白質印(yin)跡技術(shu)（免疫印(yin)跡實(shi)驗(yan)）又稱(cheng)為Western Blot。它是(shi)分子生(sheng)物(wu)學(xue)、生(sheng)物(wu)化(hua)學(xue)和免疫(yi)遺傳(chuan)學(xue)中(zhong)常(chang)用的壹(yi)種(zhong)實(shi)驗(yan)方法(fa)。Western Blot主(zhu)要用(yong)於(yu)檢(jian)測(ce)或(huo)分(fen)析蛋白，應(ying)用(yong)領(ling)域(yu)集(ji)中(zhong)在(zai)基因表(biao)達(da)研(yan)究、抗體活(huo)性(xing)檢(jian)測(ce)和疾(ji)病診斷等。

01  蛋白質印(yin)跡基本(ben)流(liu)程圖(tu)
 
02 western blot步驟(zhou)
樣品(pin)準備(bei)：

• Tanon 連續(xu)梯(ti)度(du)預制膠（4-20% 10 孔(kong)/15 孔(kong)/17 孔(kong)）；  （4-12% 10 孔(kong)/15 孔(kong)/17 孔(kong)）

• Tanon Mops/MES 電泳緩沖液(ye)（粉(fen)劑(ji)）

• Tanon 預染蛋白 Marker

• Tanon 4×LDS Loading Buffer

• Tanon 快(kuai)速蛋白染(ran)液(ye)

• 預制膠規格的選(xuan)擇(ze)

 
    
在不使用(yong)預制膠的情(qing)況(kuang)下，需要自(zi)行(xing)配(pei)置(zhi)適合蛋白電泳SDS膠(jiao)，采取自(zi)制膠的方法(fa)從(cong)加入緩沖液(ye)到(dao)制膠完成這壹(yi)過(guo)程大概需要花(hua)費將近1個小(xiao)時。並且(qie)由(you)於(yu)配(pei)比過(guo)程(cheng)中(zhong)的認(ren)為(wei)誤(wu)差容易產(chan)生(sheng)濃(nong)度(du)不均壹(yi)，穩定(ding)性(xing)差(cha)，已(yi)出現外(wai)八(ba)型、笑(xiao)臉(lian)型等(deng)條(tiao)帶。采用(yong)天(tian)能(neng)系(xi)列預制膠具有較高的穩(wen)定(ding)性(xing)和均壹(yi)性(xing)，使(shi)蛋白電泳條(tiao)帶更(geng)清晰(xi)銳(rui)利(li)，使得(de)條(tiao)帶更(geng)加(jia)均勻。還(hai)有重要的壹(yi)點(dian)就(jiu)是(shi)可以(yi)免去(qu)制膠的時(shi)間(jian)，大大提(ti)升(sheng)了實(shi)驗(yan)效(xiao)率(lv)。
 
蛋白轉印(yin)使用天(tian)能(neng)VE-586轉移(yi)電泳槽(cao)主(zhu)要優(you)勢在(zai)於(yu):它可以(yi)在不埋冰的情(qing)況(kuang)完成的蛋白電泳，如(ru)果(guo)配(pei)合快(kuai)速轉膜(mo)液(ye)，整(zheng)個(ge)電泳過(guo)程只需不到30分(fen)鐘(zhong)，可同時(shi)轉印(yin)4塊膠，操(cao)作(zuo)方法(fa)也比較(jiao)簡(jian)便(bian)。在縮短轉印(yin)時間的同時(shi)，實(shi)現了蛋白樣(yang)品(pin)的高效(xiao)轉印(yin)。
 
03  蛋白電泳
目前(qian)常(chang)用的是(shi)SDS-PAGE（十(shi)二烷(wan)基硫(liu)酸鈉-聚(ju)丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠電泳），蛋白質會根據(ju)分子量(liang)大小(xiao)分開，分(fen)子量(liang)的蛋白會留(liu)在(zai)膠的下(xia)部，分子量(liang)大的會在膠(jiao)的頂(ding)部。

 
04 轉膜(mo)
轉膜(mo)主(zhu)要是(shi)將蛋白質從凝(ning)膠(jiao)轉移(yi)到膜(mo)上(shang)，常(chang)用(yong)的是(shi)NC膜(mo)和PVDF（聚(ju)偏(pian)氟(fu)乙烯(xi)），由(you)於(yu)膜(mo)與蛋白質高度(du)親和的能(neng)力(li)，所以(yi)更(geng)容易與蛋白結(jie)合。為了便於(yu)觀(guan)察(cha)電泳效(xiao)果(guo)和轉膜(mo)效(xiao)果(guo)，可以(yi)使用(yong)蛋白預染Marker，以(yi)方便判(pan)斷蛋白分(fen)子量(liang)大小(xiao)。

蛋白預染的傳(chuan)統(tong)方法(fa)是(shi)膜(mo)將置(zhi)於(yu)脫(tuo)色(se)搖床(chuang)上，用(yong)1×麗(li)春紅(hong)染液(ye)振(zhen)蕩(dang)預染5min。然(ran)後用(yong)水(shui)沖洗掉沒染上的染(ran)液(ye)就(jiu)可看(kan)到膜(mo)上(shang)的蛋白。

蛋白轉印(yin)使用天(tian)能(neng)VE-586轉移(yi)電泳槽(cao)主(zhu)要優(you)勢在(zai)於(yu):它可以(yi)在不埋冰的情(qing)況(kuang)完成的蛋白電泳，如(ru)果(guo)配(pei)合快(kuai)速轉膜(mo)液(ye)，整(zheng)個(ge)電泳過(guo)程只需不到30分(fen)鐘(zhong)，可同時(shi)轉印(yin)4塊膠，操(cao)作(zuo)方法(fa)也比較(jiao)簡(jian)便(bian)。在縮短轉印(yin)時間的同時(shi)，實(shi)現了蛋白樣(yang)品(pin)的高效(xiao)轉印(yin)。 
05 封閉
轉印(yin)完成後(hou)，為(wei)阻止(zhi)抗體的非(fei)特(te)異性(xing)結(jie)合，需要用(yong)脫(tuo)脂牛(niu)奶(nai)或(huo)者(zhe)牛(niu)血(xue)清蛋白（BSA）作(zuo)為緩沖液(ye)來(lai)填(tian)充(chong)封閉空(kong)白(bai)結合位點(dian)。

加(jia)入(ru)二抗稀釋(shi)液(ye)（壹(yi)般(ban)1:1000甚(shen)至(zhi)1:10000用(yong)TBST稀釋(shi)），放(fang)在(zai)搖(yao)床(chuang)上，室溫下(xia)孵育(yu)1h後，用TBST在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)脫(tuo)色(se)搖床(chuang)上洗兩(liang)次，每(mei)次(ci)10min；再用TBS洗壹次，10min，即(ji)可進(jin)行(xing)化(hua)學(xue)發光反應。

註(zhu)意：二抗孵育(yu)之後(hou)也要註(zhu)意充(chong)分(fen)洗滌，壹般(ban)30min左右(you)為(wei)宜(yi)，如(ru)果(guo)洗膜(mo)不夠充(chong)分，顯影(ying)時(shi)會造成(cheng)雜(za)色(se)背景。
 
06 ECL化(hua)學(xue)發光反應：
在(zai)工作(zuo)臺(tai)上(shang)鋪壹張保鮮(xian)膜(mo)，將PVDF膜(mo)置(zhi)於(yu)保鮮(xian)膜(mo)上(shang)。將ECL的A和B兩(liang)種(zhong)試劑在(zai)EP管(guan)內等(deng)體積混合（註意吸(xi)完A試(shi)劑(ji)後吸(xi)B試劑(ji)前(qian)要更(geng)換槍頭(tou)），然(ran)後均(jun)勻滴(di)在PVDF膜(mo)的蛋白面(mian)，反(fan)應1~2min後，將PVDF膜(mo)上(shang)多(duo)余(yu)的ECL發光液(ye)吸(xi)幹，進(jin)行(xing)固定(ding)。

 
07凝膠(jiao)圖(tu)象(xiang)分析
將膠片(pian)進(jin)行(xing)掃(sao)描或(huo)拍(pai)照(zhao)，使用凝(ning)膠成(cheng)像儀進(jin)行(xing)成(cheng)像分析(xi)。常(chang)用的凝(ning)膠(jiao)成像儀有天(tian)能(neng)系(xi)列的T4600，T5200等(deng)系(xi)列。