細胞遺傳學分(fen)析中淋巴(ba)細胞微核(he)測定方(fang)法介紹(shao)

細胞遺傳學分(fen)析中淋巴(ba)細胞微核(he)測定方(fang)法介紹(shao)

淋巴(ba)細胞微核(he)測定是細胞遺傳學分(fen)析中常(chang)用的(de)方(fang)法之(zhi)壹,通(tong)過微核(he)率(lv)的高低可以(yi)有(you)效(xiao)判斷(duan)染色(se)體畸變(bian)率(lv)與(yu)輻射損傷。 

壹、淋巴(ba)細胞分離 
分離(li)使用Ficoll-Paque密(mi)度(du)梯(ti)度(du)分(fen)離(li)淋巴(ba)細胞。將血(xue)液用磷(lin)酸鹽緩沖(chong)鹽水(shui)按 1:1 稀釋(shi)，並(bing)在 Ficoll-Paque 上分(fen)層(ceng)，血(xue)液 + PBS: Ficoll 的比(bi)例保持(chi)為(wei) 4:3。血(xue)液在室溫下(xia)以(yi) 1800 rpm 離心(xin) 35 分(fen)鐘。去(qu)除(chu)淋巴(ba)細胞層（血(xue)沈棕(zong)黃(huang)層）並在 PBS 中以(yi) 1200 rpm 洗(xi)滌兩(liang)次(ci)，每(mei)次(ci) 10 分鐘，然後(hou)用培養基(ji) RPMI 1640 洗(xi)滌。用血(xue)細胞計數器計數細胞密度。

二、培養條件
淋巴(ba)細胞在 15 ml 錐形聚(ju)苯(ben)乙烯離(li)心(xin)管(guan)中的(de) 5% CO2 加(jia)濕(shi)培養箱(xiang)中於 37o 培養。通(tong)常(chang)，每(mei)個(ge)培養物(wu)由(you) 2 毫(hao)升培養基(ji)中的(de) 1x10 6 個(ge)細胞的初始(shi)密(mi)度(du)組(zu)成(cheng)。培養基(ji)由(you)補(bu)充有(you) 10% 胎(tai)牛(niu)血(xue)清 2mM L-谷(gu)氨(an)酰胺(an)、100 單(dan)位(wei)/ml 青黴(mei)素、100 ug/ml 鏈(lian)黴(mei)素和(he) 1.5% 植物血(xue)凝素(su)的(de) RPMI 1640 組(zu)成。
在起始(shi)後(hou) 44 小(xiao)時(shi)將微核(he)測定細胞松弛(chi)素 B 加入到培養物(wu)中。細胞松弛(chi)素 B 阻(zu)止細胞完成胞質分裂，導致(zhi)多(duo)核(he)細胞的形成(cheng)。細胞培養物(wu)中細胞松弛(chi)素 B 的最終(zhong)濃度(du)為(wei) 3 mg/ml。

在培養開始(shi)後(hou) 72 小(xiao)時(shi)，使用細胞離心(xin)機(ji) (Shandon, Sewickley, PA) 將淋巴(ba)細胞直接離心(xin)到載玻片上(shang)。然後(hou)將細胞以(yi) 600 rpm 的速度旋轉到載玻片上(shang) 10 分鐘。在室溫下(xia)甲醇固定 15 分鐘之(zhi)前，讓載玻片風幹。載玻片在-20℃ 下(xia)儲(chu)存在密封(feng)盒(he)中，在 N2 下(xia)幹(gan)燥(zao)。

三(san)、細胞染色與(yu)微核(he)測定
染色：將甲醇固定的載玻片在含有(you) 0.1% Tween 20 的(de) PBS 中孵(fu)育 5 分(fen)鐘。從(cong)載玻片中排(pai)出(chu)多(duo)余(yu)的(de)液體，並(bing)用含有(you) 0.2% Tween 20 的(de) PBS 1:1 稀釋(shi) 40-50 ul 抗(kang)動粒抗(kang)體應用% Tween 20。然後(hou)將載玻片蓋(gai)上(shang)蓋(gai)玻片並(bing)置於 37oC 的加(jia)濕(shi)室(shi)中 1 小(xiao)時(shi)。在含有(you) 0.1% Tween 20 的(de) PBS 中洗(xi)滌兩(liang)次(ci)，每(mei)次(ci) 5 分鐘後(hou)，再次(ci)排出多(duo)余(yu)的(de)液體，用 1:50 稀釋(shi)的(de)熒(ying)光山羊抗(kang)人(ren) IgG覆(fu)蓋(gai)載玻片並(bing)再次(ci)孵(fu)育 1 H。因(yin)為(wei)熒(ying)光標記(ji)的抗(kang)體暴(bao)露(lu)在光線(xian)下(xia)會褪色(se)，此步(bu)驟(zhou)和(he)所(suo)有(you)後(hou)續步(bu)驟(zhou)應在黃燈(deng)下(xia)進(jin)行(xing)。將載玻片在加 0.1% Tween 20 的(de)緩(huan)沖(chong)液中沖(chong)洗(xi)兩次(ci)，並在抗(kang)褪色溶液中用 4'6-二(er)脒基(ji)-2-苯(ben)基吲(yin)哚(duo) (DAPI) (2 ug/ml) 復(fu)染。

對(dui)於淋巴(ba)細胞微核(he)測試，對(dui) 1000 個(ge)雙核(he)淋巴(ba)細胞（那些經(jing)歷(li)了壹次(ci)有(you)絲(si)分裂分裂的細胞）進行(xing)檢(jian)測(ce)，每(mei)個(ge)重復(fu)培養物(wu)中的(de) 500 個(ge)細胞，用於計算(suan)微核(he)的數量(liang)。通過切(qie)換到熒(ying)光濾(lv)光片(pian)來確定動(dong)粒(li)點的存在與(yu)否。

檢測標準(zhun)如下(xia)：
1) 細胞應具有(you)完(wan)整(zheng)的(de)細胞質的圓(yuan)形或橢圓(yuan)形外(wai)觀
2) 細胞核(he)應同(tong)樣(yang)為(wei)圓形或橢圓(yuan)形，具有(you)完(wan)整(zheng)的(de)核(he)膜(mo)
3) 只(zhi)有(you)經(jing)歷(li)過壹次(ci)核(he)分裂的細胞才應檢測(ce)微核(he)的存在
4) 僅(jin)當(dang)微核(he)大小為(wei)主核(he)的三分之壹或以(yi)下(xia)時(shi)才應計數
5) 微核(he)的染色應與(yu)主核(he)相似(si)
6) 微核(he)應與(yu)主核(he)明(ming)顯分(fen)開。

復(fu)制(zhi)指(zhi)數 (RI)，細胞分裂動力(li)學的(de)量(liang)度，通(tong)過計(ji)算(suan)每(mei)個(ge)樣本(ben) 400 個(ge)總(zong)細胞中含有(you) 1、2、3 或更(geng)多(duo)細胞核(he)的細胞百分比(bi)，從對(dui)微核(he)進行(xing)檢(jian)測(ce)的(de)相同(tong)載玻片上(shang)進行(xing)檢(jian)測(ce)。
復(fu)制(zhi)指(zhi)數RI 計(ji)算如下(xia)：
      RI = (1x% 單(dan)核(he)細胞) + (2x% 雙核(he)細胞) + (3x% tri) + (4x% 四(si)核(he)細胞）……