pcr擴增(zeng)的原(yuan)理(li)和具(ju)體(ti)實驗(yan)步驟(zhou)

pcr擴增(zeng)的原(yuan)理(li)和具(ju)體(ti)實驗(yan)步驟(zhou)

PCR實(shi)驗是(shi)分子(zi)生物(wu)學中(zhong)常見(jian)用的(de)實驗(yan)之壹(yi)，在(zai)基(ji)因擴增(zeng)、核酸(suan)檢測(ce)、基(ji)因檢測(ce)等方(fang)面廣泛(fan)應(ying)用。pcr擴增(zeng)的原(yuan)理(li)和步驟(zhou)如(ru)下(xia)：

壹(yi)、試(shi)劑準(zhun)備：
PCR常(chang)用(yong)的(de)試(shi)劑主要(yao)包括(kuo) DNA 模板(ban)、引(yin)物(wu)、ddH 2 O、 DNA 聚合酶(mei)以及(ji)特(te)定(ding)的(de)反應(ying)緩沖(chong)液(ye)、dNTP、MgSO 4（可(ke)選(xuan)）和 DMSO （可選(xuan)）。 

二、PCR實(shi)驗(yan)前的(de)準(zhun)備
在(zai)開始(shi)PCR實驗之前(qian)，必須(xu)準(zhun)備好(hao)DNA模板(ban)（基(ji)因組(zu)DNA 或逆轉錄(lu)制(zhi)備的(de)cDNA）、特異性(xing)引(yin)物(wu)（自己(ji)設(she)計(ji)或用(yong)軟(ruan)件(jian)設(she)計），並選擇(ze)合適的商(shang)業(ye)酶(mei)（選(xuan)擇(ze)符合您(nin)實驗(yan)目的的(de)酶) 

1.DNA聚合酶(mei)。有許多(duo)商(shang)業(ye) DNA 聚合酶(mei)，它們具(ju)有不(bu)同(tong)的(de)特性(xing)。壹般分為兩(liang)類：高(gao)保真(zhen)聚合酶(mei)和普通(tong)Taq 聚合酶(mei)。如(ru)果(guo)您(nin)想對沒有任何突(tu)變(bian)的(de)特定(ding) DNA 片段進行(xing) PCR，請選(xuan)擇高(gao)保真(zhen)聚合酶(mei)。如(ru)果(guo)只(zhi)是(shi)想檢測(ce)特定序(xu)列(lie)的(de)存(cun)在(zai)，就(jiu)選(xuan)擇(ze)普(pu)通(tong)的(de) Taq 聚合酶(mei)。如(ru)果(guo)要(yao)對(dui)T-vector連接的(de)片段進行(xing)PCR，要註(zhu)意(yi) ，因為大(da)多(duo)數(shu)高(gao)保真(zhen)聚合酶(mei)的產物都沒有 A-tailing，所(suo)以應(ying)該選(xuan)擇(ze)普通(tong)的(de)Taq聚合酶(mei)或在(zai)PCR 實驗(yan)後(hou)添(tian)加 A-tailing。

2.引(yin)物(wu)的(de)特(te)異性(xing)影響 PCR 成(cheng)功(gong)的概(gai)率(lv)，良(liang)好(hao)的(de)引(yin)物(wu)設(she)計(ji)對(dui) PCR 擴增(zeng)的成(cheng)功至關(guan)重(zhong)要(yao)。當您開始(shi)設計引(yin)物(wu)時(shi)，應(ying)仔細考慮(lv)以下幾個(ge)原(yuan)則：
①引(yin)物(wu)的(de)長(chang)度(du)。PCR引(yin)物(wu)壹(yi)般在(zai)18-22bp左右(you)。這對於引(yin)物(wu)特(te)異性(xing)和在(zai)退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)下的(de)結(jie)合來(lai)說是(shi)足夠長的。
②熔(rong)化(hua)溫(wen)度(du)(Tm)。Tm 定義(yi)為在(zai)此(ci)溫(wen)度(du)下，DNA 雙(shuang)鏈體(ti)的壹(yi)半(ban)將解離(li)成(cheng)單(dan)鏈 DNA。52-58C 範(fan)圍(wei)內的引(yin)物(wu) Tm 是(shi)*佳的。
③GC 含(han)量(liang)。*佳 GC 含(han)量(liang)應(ying)為 40-60%。
④許多(duo)軟件(jian)可(ke)用於引(yin)物(wu)設(she)計(ji)，例(li)如(ru)primer5和Oligo。這些軟(ruan)件(jian)推(tui)薦的引(yin)物(wu)通(tong)常(chang)可(ke)以滿足我們的需(xu)求。



三(san)、 pcr實驗步驟(zhou)：
根(gen)據PCR使用(yong)說明進行(xing)試(shi)劑混合預配，並設(she)置(zhi) PCR 循(xun)環(huan)。
簡(jian)而(er)言(yan)之，pcr擴增(zeng)的原(yuan)理(li)和步驟(zhou)需(xu)要經(jing)過(guo)以下 循(xun)環(huan)：
1.初始(shi)化步驟(zhou)。這僅對(dui)熱(re)啟動(dong) PCR。此(ci)步驟(zhou)將溶(rong)液(ye)加(jia)熱(re)至 94-98°C ，以激活(huo) DNA 聚合酶(mei)。該步驟(zhou)的(de)時(shi)間(jian)取決於所(suo)使用(yong)的聚合酶(mei)。
2.變性(xing)步驟(zhou)。DNA是(shi)雙鏈分(fen)子(zi)，DNA擴增(zeng)需要(yao)引(yin)物(wu)與(yu)單(dan)鏈 DNA模板(ban)相互作用。在(zai)此(ci)步驟(zhou)中(zhong)，將反(fan)應(ying)混合物(wu)加熱(re)至 94-98°C 並保(bao)持 20-30 秒(miao)，以破(po)壞(huai)兩(liang)條鏈之間(jian)的氫(qing)鍵並生成(cheng)單(dan)鏈 DNA 分(fen)子(zi)。此(ci)時(shi)進入 PCR 循(xun)環(huan)。
3.退(tui)火(huo)步驟(zhou)。變(bian)性(xing)後(hou)，反應(ying)混合物(wu)中(zhong)的 DNA 模板(ban)是(shi)單(dan)鏈的(de)。由(you)於引(yin)物(wu)與(yu)DNA模板(ban)互補(bu)，當反應(ying)溫(wen)度(du)降低(di)到(dao) 50-65℃時(shi)，引(yin)物(wu)會(hui)與模板(ban)序列(lie)匹(pi)配(pei)，互補(bu)堿(jian)基(ji)之間(jian)形成氫(qing)鍵。退(tui)火(huo)溫(wen)度(du)取決(jue)於所(suo)用引(yin)物(wu)的(de)Tm，壹(yi)般比引(yin)物(wu)Tm 低(di) 3-5℃左(zuo)右(you)。該步驟(zhou)將持續(xu)約 20-40 秒以*退(tui)火(huo)，然(ran)後(hou)聚合酶(mei)將定(ding)位到引(yin)物(wu)- 模板(ban)雜交體(ti)以開始(shi) DNA 組(zu)裝。
4.伸(shen)長步驟(zhou)。在(zai)此(ci)步驟(zhou)中(zhong)，DNA 聚合酶(mei)開始(shi)合成(cheng) DNA，因此(ci)溫(wen)度(du)應(ying)為 DNA 聚合酶(mei)的最適溫(wen)度(du)。壹般選擇 72°C，但(dan)有(you)些酶(mei)在(zai) 68°C 時(shi)效果更(geng)好(hao)。這壹步與(yu)體(ti)內 DNA復制(zhi)非常(chang)相似，DNA聚合酶(mei)將dNTPs添(tian)加到(dao)引(yin)物(wu)中(zhong)，以 5' 到3'方(fang)向(xiang)與模板(ban)互補(bu)，最終(zhong)產生新的雙(shuang)鏈DNA片(pian)段。延伸時(shi)間(jian)取決於目(mu)標(biao) DNA 片(pian)段的長度(du)和 DNA 聚合酶(mei)的能力。壹(yi)般來說，DNA 聚合酶(mei)每 60 秒(miao)產生壹(yi)千個(ge)堿(jian)基(ji)。
5. 循(xun)環(huan)。2~4步稱(cheng)為壹個循(xun)環(huan)，每循(xun)環(huan)壹次，目(mu)標(biao)片(pian)段量(liang)翻(fan)倍。壹個 PCR 過(guo)程(cheng)使用 30-35 個循(xun)環(huan)。在(zai) PCR 循(xun)環(huan)的早期(qi)，PCR 產物以指(zhi)數(shu)速(su)率積(ji)累，而(er)在(zai) PCR 循(xun)環(huan)的後(hou)期(qi)，隨(sui)著(zhe) dNTPs、引(yin)物(wu)的(de)減少(shao)和 DNA 聚合酶(mei)在(zai)變性(xing)溫(wen)度(du)下的(de)失(shi)活(huo)，反(fan)應(ying)減慢(man)，PCR 速率(lv)逐(zhu)漸下(xia)降。
6.終(zhong)伸(shen)長(chang)率(lv)。30-35個(ge)循(xun)環(huan)結(jie)束(shu)後(hou)，在(zai)68-74℃的溫(wen)度(du)下終(zhong)延(yan)伸(shen)約(yue) 5-10分(fen)鐘(zhong)，以充分延(yan)伸(shen)剩(sheng)余的(de)單(dan)鏈DNA。
7.貯(zhu)存(cun)。產品可以在(zai) PCR 機(ji)器中(zhong)維(wei)持溫(wen)度(du)在(zai) 4-10°C。

更(geng)多(duo)熒(ying)光(guang)定量(liang)PCR報(bao)價(jia)相關(guan)問題進入蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生物(wu)實驗(yan)器材(cai)有(you)限(xian)公(gong)司網站咨(zi)詢。