CRISPR 激(ji)活(huo)與(yu)幹(gan)擾篩(shai)選技術原(yuan)理

    在(zai)自身(shen)免(mian)疫(yi)、免(mian)疫(yi)缺(que)陷(xian)和癌癥(zheng)中，受(shou)刺激(ji)的(de) T 細(xi)胞中細(xi)胞因子(zi)產生的(de)調節可能會被破壞。刺激(ji)依(yi)賴(lai)性細(xi)胞因子(zi)調節(jie)劑(ji)的(de)系(xi)統發(fa)現(xian)需(xu)要功(gong)能喪失和功(gong)能獲得(de)研(yan)究(jiu)，這在(zai)人(ren)類(lei)原(yuan)代(dai)細(xi)胞中壹(yi)直具(ju)有挑(tiao)戰(zhan)性。通(tong)過(guo)報(bao)告(gao)人(ren)類(lei)原(yuan)代(dai) T 細(xi)胞中的(de)全基因組 CRISPR 激(ji)活(huo) (CRISPRa) 和幹(gan)擾 (CRISPRi) 篩(shai)選，以識(shi)別控制(zhi)白介素(su)-2 (IL-2) 和幹(gan)擾素(su)-γ (IFN-γ) 產生的(de)基因網絡。

CRISPR 激(ji)活(huo)與(yu)幹(gan)擾篩(shai)選技術概(gai)述

  《科(ke)學》雜誌(zhi)中(zhong)關(guan)於(yu)CRISPR 激(ji)活(huo)、篩(shai)選有新進展，CRISPR 激(ji)活(huo) (CRISPRa) 和 CRISPR 幹(gan)擾 (CRISPRi) 篩(shai)選是測(ce)試基(ji)因功(gong)能得(de)失(shi)的(de)強大(da)工具(ju)，但(dan)它(ta)們的使用在(zai)很大程度上(shang)僅(jin)限(xian)於(yu)永生化(hua)細(xi)胞系。Smite等(deng)人(ren)報(bao)告(gao)了(le)壹(yi)種優化(hua)方法，使他們能夠對(dui)人(ren)類(lei)原(yuan)代(dai) T 細(xi)胞進行全基因組 CRISPRa 和 CRISPRi 篩(shai)選。然後，這種方法被用來(lai)檢查(zha)調節(jie)關(guan)鍵(jian)治療相(xiang)關(guan)細(xi)胞因子(zi)產生的(de)基因。然後將合並(bing)的(de) CRISPRa 擾(rao)動與(yu)單細(xi)胞 RNA 測序 (CRISPRa Perturb-seq) 相(xiang)結合，使他們能夠探(tan)究(jiu)細(xi)胞因子(zi)產生的(de)調節劑(ji)如(ru)何(he)控制(zhi) T 細(xi)胞活化(hua)並編(bian)程為不同(tong)的(de)活(huo)化(hua)後狀(zhuang)態.
人(ren)類(lei) T 細(xi)胞對(dui)抗(kang)原刺激(ji)的(de)反(fan)應，包(bao)括細(xi)胞因子(zi)的產生，對(dui)健(jian)康的(de)免(mian)疫(yi)功(gong)能至關重(zhong)要，並且(qie)可(ke)能在(zai)自身(shen)免(mian)疫(yi)、免(mian)疫(yi)缺(que)陷(xian)和癌癥(zheng)中失(shi)調。系(xi)統地(di)了(le)解(jie)調(tiao)節(jie) T 細(xi)胞激(ji)活(huo)與(yu)功能獲得(de)和功(gong)能喪失基(ji)因擾動(dong)的調(tiao)節(jie)劑(ji)將提(ti)供(gong)對(dui)疾(ji)病(bing)途徑(jing)的(de)更(geng)多見(jian)解，並為設(she)計(ji)下(xia)壹(yi)代(dai)免(mian)疫(yi)療法提(ti)供(gong)更(geng)多機(ji)會。

CRISPR 激(ji)活(huo)與(yu)幹(gan)擾篩(shai)選的基(ji)本(ben)原(yuan)理

盡管(guan) CRISPR 激(ji)活(huo) (CRISPRa) 和 CRISPR 幹(gan)擾 (CRISPRi) 篩(shai)選是在(zai)永生化(hua)細(xi)胞系中(zhong)進行功(gong)能獲得(de)和功(gong)能喪失研(yan)究的強大(da)工具(ju)，但(dan)在(zai)原代(dai)細(xi)胞類(lei)型(xing)中(zhong)大(da)規(gui)模部(bu)署它(ta)們壹直(zhi)具(ju)有挑(tiao)戰(zhan)性。在(zai)這裏(li)，研究(jiu)團隊在(zai)原代(dai)人(ren)類(lei) T 細(xi)胞中開(kai)發(fa)了(le)壹(yi)個(ge) CRISPRa 和 CRISPRi 發(fa)現(xian)平臺(tai)，並對(dui)響(xiang)應(ying)刺激(ji)的(de)細(xi)胞因子(zi)產生的(de)功能調節劑(ji)進行了(le)全基因組篩(shai)選。由(you)於(yu) T 細(xi)胞中內源白介素(su)-2 (IL-2) 產生或(huo) CD8 中(zhong)幹(gan)擾素(su)-γ (IFN-γ) 產生的(de)水(shui)平，通(tong)過(guo)熒(ying)光(guang)激(ji)活(huo)細(xi)胞分選到高(gao)和低(di)箱(xiang)中(zhong)分離 CRISPRa 擾(rao)動(dong)細(xi)胞池(chi)+ T 細(xi)胞。命(ming)中包(bao)括近端(duan) T 細(xi)胞受體(ti) (TCR) 信號通(tong)路(lu)基因(yin)，表(biao)明(ming)這些成(cheng)分的過(guo)表(biao)達可(ke)以(yi)克(ke)服信號“瓶頸"並(bing)調(tiao)節(jie)刺激(ji)和細(xi)胞因子(zi)的產生。
    使用 CRISPRi 的(de)互惠全基因組功能喪失篩(shai)選檢測(ce)到(dao)具(ju)有關鍵(jian)調(tiao)節(jie)功能的命(ming)中，包(bao)括 CRISPRa 遺漏的(de)壹些命(ming)中。相(xiang)比之(zhi)下，CRISPRa 還(hai)發(fa)現(xian)了(le)可(ke)能不需(xu)要的(de)命(ming)中，在(zai)某(mou)些情(qing)況下，在(zai)篩(shai)選條(tiao)件下(xia)僅(jin)以(yi)低水(shui)平表達(da)。核(he)因(yin)子(zi) κ B (NF-κB) 信號通(tong)路(lu)對(dui) IFN-γ 產生的(de)調節有力地(di)證明(ming)了(le)這壹(yi)點，其中(zhong) CRISPRi 確定了(le)所(suo)需(xu)的 TCR-NF-κB 信號通(tong)路(lu)（包括MALT1和BCL10）。CRISPRa 選擇性地(di)檢(jian)測(ce)到(dao)壹(yi)組也通(tong)過(guo) NF-kB 發(fa)出(chu)信號的(de)腫(zhong)瘤壞死因子超家(jia)族(zu)受體，包括 4-1BB、CD27、CD40 和 OX40。在(zai)他們的實驗條(tiao)件下(xia)，這些受(shou)體(ti)並(bing)不是(shi)單獨(du)信號傳(chuan)導所(suo)必(bi)需(xu)的，但(dan)在(zai)過度表(biao)達(da)時可以(yi)促(cu)進 IFN-γ。因此(ci)，CRISPRa 和 CRISPRi 在(zai)功能性細(xi)胞因子(zi)調節(jie)劑(ji)的(de)全面發(fa)現(xian)方面相互(hu)補(bu)充(chong)。陣列 CRISPRa 擾(rao)動(dong)驗(yan)證了(le)關(guan)鍵(jian)命(ming)中對(dui) CD4 +和 CD8 + T 細(xi)胞的影響(xiang)。他(ta)們還通(tong)過(guo)測量(liang)壹組(zu)分泌的(de)細(xi)胞因子(zi)和趨(qu)化(hua)因(yin)子(zi)，評(ping)估了(le)單個 CRISPRa 擾動如何(he)更(geng)廣(guang)泛地(di)重(zhong)新(xin)編(bian)程 IL-2 和 IFN-γ 之(zhi)外(wai)的細(xi)胞因子(zi)產生。


新(xin)平臺(tai)的開(kai)發(fa)與(yu)支持(chi)
   Smite團隊還(hai)開發(fa)了(le)壹(yi)個(ge)平臺(tai)，用於(yu)在(zai)原代(dai)人(ren)類(lei) T 細(xi)胞中結合單細(xi)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 讀(du)數(shu) (CRISPRa Perturb-seq) 進行合並(bing) CRISPRa 擾(rao)動(dong)。他們使用 CRISPRa Perturb-seq 對(dui)由(you) 70 個全基因組篩(shai)選命(ming)中和對(dui)照(zhao)引(yin)起(qi)的(de)單細(xi)胞狀(zhuang)態進行深度分子表(biao)征(zheng)，以揭示(shi)細(xi)胞因子(zi)產生的(de)調節劑(ji)如(ru)何(he)調節(jie) T 細(xi)胞活化(hua)並將細(xi)胞編程為不同(tong)的(de)刺激(ji)響(xiang)應(ying)狀(zhuang)態。
    他們的研(yan)究(jiu)證明(ming)了(le)壹(yi)個(ge)強大(da)的(de)平臺(tai)，用於(yu)在(zai)原代(dai)人(ren)類(lei) T 細(xi)胞中大(da)規(gui)模匯(hui)集(ji) CRISPRa 和 CRISPRi。成(cheng)對(dui)的(de) CRISPRa 和 CRISPRi 篩(shai)選能夠對(dui)可(ke)以(yi)調(tiao)節細(xi)胞因子(zi)產生的(de)基因網絡進行全面的功(gong)能定位。通(tong)過(guo)陣列表(biao)型(xing)分析和匯(hui)集(ji)的(de) scRNA-seq 方法對(dui) CRISPRa 命(ming)中進行跟(gen)蹤，可(ke)以對(dui)關(guan)鍵(jian)篩(shai)選命(ming)中進行精確的功(gong)能表征，揭示(shi)關鍵(jian)擾(rao)動(dong)如何將 T 細(xi)胞調整(zheng)到(dao)治療相(xiang)關(guan)狀(zhuang)態。未來(lai)在(zai)原代(dai)細(xi)胞中進行的(de) CRISPRa 和 CRISPRi 篩(shai)選可以(yi)確定改(gai)進的下(xia)壹(yi)代(dai)細(xi)胞療法的(de)目標。
研究學家(jia)Arrayed CRISPRa 確認了(le)關(guan)鍵(jian)命(ming)中並(bing)啟用了(le)多重(zhong)分泌組(zu)表(biao)征，揭示(shi)了(le)重(zhong)塑(su)的細(xi)胞因子(zi)反(fan)應。將 CRISPRa 篩(shai)選與(yu)單細(xi)胞 RNA 測序相(xiang)結合，可(ke)以(yi)對(dui)篩(shai)選命(ming)中進行深度分子表(biao)征(zheng)，揭示(shi)了(le)擾(rao)動(dong)如(ru)何(he)調節 T 細(xi)胞活化(hua)並促(cu)進以不同(tong)細(xi)胞因子(zi)表達(da)譜為特(te)征(zheng)的細(xi)胞狀(zhuang)態。這些篩(shai)選揭示(shi)了(le)重(zhong)新(xin)編(bian)程關鍵(jian)免(mian)疫(yi)細(xi)胞功能的基因(yin)，這也為免(mian)疫(yi)療法的(de)設(she)計(ji)提(ti)供(gong)參(can)考(kao)。

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