使(shi)用生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)培(pei)養(yang)系統(tong)制備小鼠心臟(zang)細胞片(pian)的(de)實(shi)驗方(fang)法(fa)

標(biao)簽(qian)：生物(wu)反應器(qi) 成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞  科普(pu) 胰蛋白(bai)酶 

實(shi)驗前準備和實(shi)驗方(fang)法(fa)

1.動物(wu)和試劑

野(ye)生型(xing) C57BL/6 小鼠。以下抗(kang)體(ti)用(yong)於(yu)免疫細胞化學：抗肌節 α-肌(ji)動蛋白(bai) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)、抗心(xin)肌肌(ji)鈣蛋白(bai) T 和抗(kang)肌球蛋白(bai)重(zhong)鏈(lian) 小鼠單克(ke)隆(long)抗(kang)體(ti)和豚(tun)鼠單克(ke)隆(long)抗(kang)波(bo)形(xing)蛋白(bai)抗體(ti)。除非(fei)另(ling)有(you)說(shuo)明，試劑品(pin)牌選(xuan)用Sigma。

2.小鼠 ES 細胞培(pei)養(yang)

維(wei)持在(zai)α-肌球(qiu)蛋白(bai)重(zhong)鏈(lian)啟動子(zi)控(kong)制下表達EGFP的小鼠ES細胞 。R1 ES 細胞普(pu)遍(bian)表達 EYFP、在(zai) α-肌球(qiu)蛋白(bai)重(zhong)鏈(lian)啟動子(zi)和潮(chao)黴(mei)素(su)抗(kang)性基(ji)因上(shang)遊(you)的磷酸(suan)甘油(you)酸激(ji)酶控(kong)制下的(de)新(xin)黴(mei)素(su)磷酸(suan)轉移酶基(ji)因，進(jin)行(xing)維(wei)持。

3.生物反(fan)應(ying)器(qi)系統(tong)

     生(sheng)物反應器(qi)培(pei)養(yang)系統(tong)采(cai)用使(shi)用1L左(zuo)右(you)的臺式細胞培(pei)養(yang)生物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)。該(gai)生(sheng)物(wu)反(fan)應器(qi)配(pei)備(bei)有(you)溫(wen)度(du)傳(chuan)感(gan)器(qi)、PH控(kong)制系統(tong)、和溶(rong)氧度(du)感(gan)應(ying)系統(tong),，以(yi)及補料(liao)、收(shou)獲和樣(yang)品(pin)端(duan)口。數據(ju)采(cai)集及過(guo)程(cheng)控(kong)制均(jun)采(cai)用微(wei)電腦(nao)自動化控(kong)制，生物(wu)反應(ying)器(qi)內部的(de)空(kong)氣(qi)、氧氣(qi)或(huo)氮氣(qi)將溶(rong)解(jie)氧維(wei)持在(zai)40%左(zuo)右(you)為宜。通(tong)過(guo) CO 將 pH 值(zhi)保持在(zai) 7.22培養(yang)基(ji)呈(cheng)堿性時(shi)加入(ru)；當介(jie)質(zhi)呈(cheng)酸性時(shi)，不調(tiao)節 pH 值(zhi)。溫(wen)度(du)保持在(zai)37°C。使(shi)用帶(dai)有(you) CCD 相(xiang)機的(de)運(yun)動分析顯微鏡記(ji)錄容(rong)器(qi)中 EB 的(de)流(liu)動。也(ye)可以在(zai) CO2 培養(yang)箱中使(shi)用配(pei)備(bei)不(bu)調(tiao)節條(tiao)件(jian)的傳(chuan)感(gan)器(qi)的(de)容(rong)器(qi)作為對照(zhao)。

(上圖為(wei)：生(sheng)物(wu)反應(ying)器(qi)系統(tong)中培(pei)養(yang)基(ji)中溶(rong)解(jie)氧濃(nong)度對細胞增(zeng)殖和心(xin)臟(zang)分化的影響)

4.生物反(fan)應(ying)器(qi)培(pei)養(yang)

     對於(yu)檢(jian)查(zha)心(xin)臟(zang)分化功效的實(shi)驗，我們(men)使(shi)用 100-ml 或(huo)1L細胞罐(guan)培養(yang) EMG7 ES 細胞，在(zai)生物(wu)反應器(qi)中添加(jia) 10% FBS、非(fei)必(bi)需(xu)氨(an)基(ji)酸 (Invitrogen) 和丙(bing)酮(tong)酸(suan)鈉(na)的格拉斯哥必需(xu)培養(yang)基(ji) (Invitrogen)。胰蛋白(bai)酶消(xiao)化後，將 1×10 7 個mES 細胞重(zhong)新(xin)懸(xuan)浮(fu)在(zai) 100 ml 分化培養(yang)基(ji)（1×10 5 個細胞/ml）中，並(bing)接種到(dao) 100-ml 攪拌生(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)中。第(di)3天，收集培養(yang)在(zai)容(rong)器(qi)中的(de)EB，在(zai)相(xiang)同條(tiao)件(jian)下重(zhong)新(xin)接種到(dao)4個新(xin)容(rong)器(qi)中，每(mei)天*更換(huan)培養(yang)基(ji)（100 ml/天）或連續(xu)更換(huan)（100 ml/天）。

（下圖為(wei)：生(sheng)物(wu)反應器(qi)系統(tong)中葉(ye)輪(lun)攪拌速度對細胞增(zeng)殖的影響）

      用於(yu)收(shou)集心肌細胞以(yi)創建細胞片(pian)，1×10 7使(shi)用 100-ml 或(huo) 1-L 培(pei)養(yang)容(rong)器(qi)培(pei)養(yang) R1 mES 細胞，DMEM 補充有(you) 15% FBS、非(fei)必需(xu)氨(an)基(ji)酸、丙(bing)酮(tong)酸(suan)鈉(na)和 L-谷氨(an)酰(xian)胺 (Invitrogen)。對於(yu) 100 ml 培(pei)養(yang)，第 3 天容(rong)器(qi)中的(de) EB 在(zai)相(xiang)同條(tiao)件(jian)下重(zhong)新(xin)接種到(dao) 4 個新(xin)容(rong)器(qi)中，每(mei)天*更換(huan)培養(yang)基(ji)（100 ml/天）或連續(xu)更換(huan)（100 ml/天） ）。對於(yu) 1-L 培(pei)養(yang)，在(zai)第 3 天將兩(liang)個容(rong)器(qi)中的(de) EB 在(zai)相(xiang)同條(tiao)件(jian)下重(zhong)新(xin)接種到(dao) 1-L 容(rong)器(qi)中，但(dan)攪拌速率除(chu)外（100-ml 培(pei)養(yang)，85 rpm；1-L 培養(yang)，65 rpm） . 連續(xu)更換(huan)培養(yang)基(ji)（1 L/天）。對於(yu)含(han)有(you)生(sheng)長因子(zi)的(de) 1-L 培養(yang)物，在(zai)生物(wu)反應器(qi)培(pei)養(yang)開始(shi)前 3 天到(dao)後 1 天用 Noggin (150 ng/mL) 培養(yang)細胞，從(cong)生物反(fan)應(ying)器(qi)培(pei)養(yang)的第(di) 6 天到(dao)第 10 天用 GCSF (1 ng/mL) 培養(yang)細胞。在(zai)用 0.25% 胰(yi)蛋白(bai)酶/EDTA 解(jie)離(li) EB 後測量(liang)每(mei)個(ge)時(shi)間點的(de)細胞數。對於(yu)心(xin)肌(ji)細胞的(de)純化，從(cong)心臟(zang)分化的第 10 天到(dao)第 18 天，將 400 µg/ml G418 添加(jia)到(dao)培養(yang)物中。在(zai)壹些實驗中，將 R1 ES 細胞培(pei)養(yang)在(zai)壹個類似的(de) 100-ml 生(sheng)物反應(ying)器(qi)容(rong)器(qi)中，作為對照(zhao)，在(zai) CO2 培養(yang)箱中進(jin)行(xing)調(tiao)節。

（下(xia)圖為(wei)：心(xin)臟(zang)基(ji)因mRNA表達水平(ping)的比(bi)較）

5.流(liu)式細胞儀(yi)分析和熒(ying)光(guang)激(ji)活細胞分選(xuan)

每(mei)個時(shi)間點的(de) EB 與(yu) 0.25% 胰蛋白(bai)酶/EDTA 解(jie)離(li) 30 分鐘(zhong)，並(bing)使(shi)用流(liu)式細胞儀(yi)分析 GFP(+) 細胞的(de)百(bai)分比(bi)。對於(yu)細胞分選(xuan)，可(ke)使(shi)用流(liu)式細胞分篩(shai)系統(tong)進(jin)行(xing)熒(ying)光(guang)激(ji)活細胞分選(xuan)。EB5 mES 細胞用(yong)作陰性對照(zhao)。

6.生(sheng)化分析

每(mei)天從(cong)生物反(fan)應(ying)器(qi)培(pei)養(yang)系統(tong)收(shou)集培養(yang)上清液。使(shi)用生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)進(jin)行(xing)葡(pu)萄(tao)糖(tang)、乳(ru)酸、谷氨(an)酰(xian)胺和谷氨(an)酸(suan)的(de)測(ce)定(ding)。

7. RNA提取(qu)和RT-PCR

下(xia)壹步按照基(ji)因學(xue)實(shi)驗步(bu)驟(zhou)進行(xing)總 RNA 提取(qu)和 RT-PCR 。定(ding)量(liang)PCR可(ke)使(shi)用朗(lang)基(ji)Q2000B進行(xing)PCR實(shi)驗，實(shi)驗條(tiao)件(jian)為 94°C 初(chu)始(shi)變性 15 秒(miao)，而(er)後 55°C， 30 秒和 72°C， 35 秒(miao)的 60 個循(xun)環(huan)，然後在(zai) 60-95°C 進行(xing)熔(rong)解(jie)曲(qu)線(xian)分析。使(shi)用 GAPDH mRNA 水平(ping)的標(biao)準曲(qu)線(xian)計算相(xiang)對 mRNA 表達水平(ping)。對於(yu)每(mei)個(ge)基(ji)因，所有(you)樣(yang)品(pin)至少獨(du)立分析 3 次。

8.免疫細胞化學

細胞用(yong) 4% 多(duo)聚(ju)甲醛(quan)固(gu)定(ding)，進行(xing)免疫染(ran)色。再通過(guo)激(ji)光(guang)共(gong)聚(ju)焦顯微鏡、熒(ying)光(guang)顯微鏡和凝(ning)膠(jiao)成(cheng)像系統(tong)進(jin)行(xing)細胞免疫分析。

9.細胞分離(li)

從(cong)新(xin)生小鼠（1-2 天齡）的心(xin)臟(zang)中獲得(de)心(xin)臟(zang)成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞。來(lai)自第(di)4代的心臟(zang)成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞用(yong)於(yu)實(shi)驗。免疫細胞化學分析顯示(shi)>99% 的心臟(zang)成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞表達波(bo)形(xing)蛋白(bai)，不表達血管(guan)性血(xue)友(you)病(bing)因子(zi)（內皮細胞標(biao)記(ji)）或(huo) NG2（周細胞標(biao)記(ji)）。

10.細胞接種

將從(cong)成(cheng)年小鼠分離(li)的(de)ES細胞衍生(sheng)的(de)心(xin)肌細胞和真(zhen)皮成(cheng)纖(xian)維(wei)細胞的(de)混合(he)細胞懸(xuan)液以3.2×10 5 個(ge)細胞/cm 2接種到(dao)細胞培(pei)養(yang)瓶中，細胞在(zai)添加(jia)了(le)15% FBS的(de)DMEM中於(yu)37℃培(pei)養(yang)。培養(yang) 2 天後，使(shi)用細胞片(pian)堆疊操作技術收(shou)獲細胞片(pian)並(bing)分層。

11.細胞片(pian)的(de)組織學(xue)和免疫組織化學分析

為(wei)了(le)觀察(cha)多(duo)層細胞片(pian)的(de)橫(heng)截(jie)面，多(duo)層細胞片(pian)用(yong)4%多(duo)聚(ju)甲醛(quan)固(gu)定(ding)，並常(chang)規(gui)加(jia)工成(cheng)3mm厚的石(shi)蠟(la)包埋切片(pian)。通(tong)過(guo)常(chang)規(gui)方(fang)法(fa)進(jin)行(xing)蘇木精和伊(yi)紅（HE）染(ran)色和azan染(ran)色。

12.統(tong)計分析

數據(ju)表示(shi)為平(ping)均(jun)值(zhi)±標準偏(pian)差(cha)。通(tong)過(guo)學(xue)生t檢驗或(huo)方(fang)差(cha)分析評(ping)估(gu)組間差(cha)異(yi)，然後進行(xing) Bonferroni 校(xiao)正(zheng)以(yi)比(bi)較平(ping)均(jun)值(zhi)。p <0.05的值(zhi)被認為(wei)具(ju)有(you)靜(jing)態(tai)顯著性。

     蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物實驗器(qi)材(cai)有(you)限(xian)公司13年來(lai)專(zhuan)註(zhu)於(yu)實(shi)驗室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)及實驗耗材(cai)的(de)供應(ying)，我們(men)除(chu)供(gong)應(ying)1L,1.5L,2L,5L,10L,100L,150L等(deng)固(gu)定(ding)規格的玻(bo)璃生(sheng)物(wu)反(fan)應(ying)器(qi)、不(bu)銹鋼(gang)發(fa)酵罐(guan)外，還(hai)可(ke)根(gen)據(ju)客(ke)戶要(yao)求的尺寸進行(xing)定(ding)制發(fa)酵罐(guan)或生(sheng)物反(fan)應器(qi)，可(ke)用(yong)於(yu)HEK293細胞培(pei)養(yang),懸(xuan)浮(fu)細胞培(pei)養(yang)、貼壁(bi)細胞培(pei)養(yang)、微載(zai)體(ti)培(pei)養(yang)、微生(sheng)物(wu)培(pei)養(yang)、抗體(ti)生(sheng)產(chan)等(deng)，規(gui)格有(you)等(deng)實現(xian)了(le)廠商直供，壹罐(guan)多(duo)用(yong)，滿足(zu)不(bu)同的用(yong)戶需(xu)求。蘇州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物還(hai)同時(shi)提供(gong)免費的(de)安裝(zhuang)服務(wu)、免費技術支持、免費操作指導(dao)等(deng)服務(wu)。