活細胞成像(xiang)系(xi)統對顯(xian)微鏡的(de)要求

   在(zai)設(she)計(ji)用(yong)於活細胞成像(xiang)研(yan)究(jiu)的光學顯(xian)微鏡系(xi)統時，主(zhu)要考慮因(yin)素(su)是檢測(ce)器(qi)靈敏(min)度（信噪比(bi)）、所需的(de)圖(tu)像(xiang)采集速(su)度和樣本活力。在(zai)使(shi)用活細胞時，必(bi)須嚴(yan)格避(bi)免(mian)在(zai)記(ji)錄固定(ding)細胞和組(zu)織的(de)圖(tu)像(xiang)時通(tong)常使(shi)用的相(xiang)對較高的(de)光強度和較長(chang)的曝光時間(jian)（其中(zhong)光漂(piao)白是(shi)主(zhu)要考慮因(yin)素(su)）。幾(ji)乎在(zai)所(suo)有(you)情況(kuang)下，活細胞顯(xian)微鏡都(dou)代表了實現較佳圖(tu)像(xiang)質量(liang)和保(bao)持細胞健(jian)康(kang)之間的折衷。
   原則上(shang)，理(li)想的(de)活細胞圖(tu)像(xiang)采集系(xi)統應(ying)該足夠(gou)靈敏(min)，可(ke)以從弱熒光標(biao)本中(zhong)采集優質圖(tu)像(xiang)，同(tong)時足(zu)夠快以記錄所有(you)動態(tai)過程。此(ci)外(wai)，該系統將具(ju)有足(zu)夠的分辨率(lv)來(lai)捕(bu)捉(zhuo)精細的(de)樣本細節和(he)能(neng)夠準(zhun)確(que)測(ce)量微(wei)小的強度差異(yi)的寬動態(tai)範(fan)圍。但是(shi)，如果優化這(zhe)些標準(zhun)中(zhong)的任(ren)何壹個都(dou)是(shi)以犧牲(sheng)其他標準(zhun)為(wei)代(dai)價的(de)。因(yin)此(ci)，目前不(bu)可能(neng)設計(ji)出(chu)適(shi)合所有可(ke)能(neng)研究(jiu)範(fan)圍的通(tong)用活細胞成像(xiang)系(xi)統。反而，研究(jiu)人員(yuan)必(bi)須通(tong)過確定(ding)較重(zhong)要(yao)的優化參(can)數(shu)來(lai)做出妥協，同(tong)時仍(reng)然(ran)試(shi)圖(tu)限(xian)制那(na)些被(bei)認(ren)為不(bu)太感(gan)興(xing)趣的變(bian)量所(suo)做出的(de)犧(xi)牲。較後，顯(xian)微鏡配(pei)置(zhi)較終(zhong)取決(jue)於成像(xiang)模(mo)式(shi)的要(yao)求、在(zai)實(shi)驗過程中(zhong)保(bao)持標本活力的(de)必(bi)要性(xing)、標記(ji)協議(yi)的(de)難(nan)度級別以及設(she)備(bei)的(de)可(ke)用(yong)性。

活細胞成像(xiang)技術
活細胞成像(xiang)是(shi)在(zai)光學顯(xian)微鏡中(zhong)使(shi)用廣泛的對(dui)比度增強成像(xiang)模(mo)式(shi)進行(xing)的。大(da)多數(shu)研(yan)究(jiu)涉(she)及(ji)某(mou)種(zhong)形式(shi)的熒光顯(xian)微鏡，通(tong)常與(yu)壹種或多(duo)種(zhong)透射光技術相(xiang)結(jie)合。比(bi)如(ru)：熒光技術包括傳(chuan)統的寬場(chang)落射熒光、激(ji)光掃(sao)描共聚(ju)焦(jiao)、旋轉盤和(he)掃(sao)場(chang)共聚(ju)焦(jiao)、多光子(zi)、全(quan)內反射 ( TIRF )、熒光相(xiang)關光譜(pu)、壽命(ming)成像(xiang) ( FLIM )、光活化和(he)激(ji)光捕(bu)獲(huo)。作為(wei)壹個子(zi)集(ji)，它(ta)包含：光譜(pu)成像(xiang)、多(duo)色成像(xiang)、共(gong)定位(wei)、延時序(xu)列、光漂(piao)白恢(hui)復技術（FRAP、FLIP和(he)FLAP)、共(gong)振(zhen)能(neng)量轉(zhuan)移(yi) ( FRET )、散(san)斑顯(xian)微鏡 ( FSM ) 和(he)膜片(pian)鉗(qian)通(tong)常與(yu)壹種或多(duo)種(zhong)主(zhu)要成像(xiang)模(mo)式(shi)耦(ou)合。熒光技術可(ke)以輔(fu)以傳(chuan)統的明場(chang)模式(shi)，包括微(wei)分幹涉(she)對(dui)比 ( DIC )、霍(huo)夫(fu)曼(man)調制對(dui)比(bi) ( HMC)) 和相(xiang)位(wei)對比(bi)，作(zuo)為(wei)熒光探(tan)針(zhen)定(ding)位(wei)的確(que)認(ren)。在(zai)幾(ji)乎所(suo)有情況(kuang)下，每種顯(xian)微鏡配(pei)置(zhi)都需要(yao)壹些*的考慮因(yin)素(su)，這(zhe)些因(yin)素(su)必(bi)須實(shi)施(shi)才能(neng)成功進(jin)行(xing)活細胞成像(xiang)。無(wu)論采用何種顯(xian)微鏡和(he)數(shu)碼相(xiang)機系(xi)統對活細胞和組(zu)織進(jin)行(xing)成像(xiang)，兩(liang)個較重(zhong)要(yao)和限(xian)制因(yin)素(su)是維(wei)持細(xi)胞活力和(he)實(shi)現(xian)高於背景(jing)噪聲(sheng)和(he)自發熒光的(de)可能(neng)信號(hao)水(shui)平(ping)。
活細胞成像(xiang)中(zhong)的信(xin)噪比(bi)
      固定(ding)細胞成像(xiang)和(he)活細胞成像(xiang)之間的根(gen)本區(qu)是：固(gu)定細胞成像(xiang)為(wei)研究(jiu)人員(yuan)提(ti)供(gong)了足夠的空(kong)間來(lai)定(ding)義(yi)圖(tu)像(xiang)采集參(can)數(shu)，例如定(ding)位(wei)合適(shi)的(de)視(shi)場(chang)和確(que)定曝光時間(jian)，以及調(tiao)整電子(zi)增益設置(zhi)、讀(du)出率(lv)和(he)偏(pian)移值(zhi)。因(yin)此(ci)，在(zai)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下（使(shi)用充(chong)分染色(se)的固(gu)定標本）可以獲(huo)得利(li)用(yong)相(xiang)機系(xi)統的全動態(tai)範(fan)圍的圖(tu)像(xiang)，從(cong)而產(chan)生(sheng)較佳的信(xin)噪比(bi)。由於維(wei)持細(xi)胞活力的(de)嚴(yan)格要求對成像(xiang)參(can)數(shu)的(de)限制，活細胞的情(qing)況(kuang)會有(you)所(suo)不(bu)同(tong)。對(dui)於獲(huo)得的(de)活細胞圖(tu)像(xiang)，樣(yang)本的強度通(tong)常只(zhi)比背(bei)景(jing)的強度高幾(ji)個灰(hui)度級。在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下，探(tan)測(ce)器(qi)系(xi)統的暗電流和讀(du)取噪聲(sheng)水(shui)平(ping)成為(wei)細(xi)胞成像(xiang)所(suo)必(bi)要考慮的條(tiao)件(jian)。  經濟(ji)型(xing)相(xiang)機通(tong)常具(ju)有較高的(de)噪聲(sheng)水(shui)平(ping)，這(zhe)樣(yang)會(hui)導致背景(jing)圖(tu)像(xiang)不(bu)太均(jun)勻(yun)，通(tong)常會(hui)掩(yan)蓋(gai)來(lai)自(zi)樣(yang)本的信號(hao)，隨著(zhe)讀(du)出速(su)度的提(ti)高，這(zhe)種(zhong)影(ying)響會變(bian)得(de)更加嚴(yan)重(zhong)。所(suo)以在(zai)幾(ji)乎所(suo)有活細胞成像(xiang)應(ying)用中(zhong)，檢測(ce)器(qi)的(de)選擇(ze)對於決(jue)定實驗的成敗至(zhi)關重(zhong)要(yao)。
其實，數(shu)字(zi)成像(xiang)中(zhong)的四(si)個主(zhu)要噪聲(sheng)源來(lai)自(zi)探(tan)測(ce)器(qi)、照明系(xi)統、泊松噪聲(sheng)或散(san)粒(li)噪聲(sheng)（由(you)於光子(zi)通(tong)量的(de)隨機性）和雜(za)散光。在(zai)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下，可(ke)以通(tong)過仔(zai)細(xi)選擇(ze)檢測器(qi)和(he)優化照明條(tiao)件(jian)來(lai)系(xi)統地降(jiang)低(di)噪聲(sheng)。幾(ji)乎每種類型(xing)的(de)光子(zi)探(tan)測(ce)器(qi)都(dou)會(hui)在(zai)設(she)備(bei)記(ji)錄的每次測量中(zhong)引入某(mou)種(zhong)形式(shi)的噪聲(sheng)。激(ji)光掃(sao)描和多(duo)光子(zi)顯(xian)微鏡中(zhong)使(shi)用的光電倍增管可(ke)以在(zai)信(xin)號(hao)放(fang)大(da)系統內產(chan)生(sheng)雜(za)散電子(zi)。
為(wei)了克(ke)服(fu)傳(chuan)統高性(xing)能(neng) CCD 相(xiang)機在(zai)需要(yao)在(zai)極(ji)低(di)光照水(shui)平(ping)下(xia)快速(su)捕捉(zhuo)幀速(su)率(lv)的(de)應(ying)用的缺點，制造(zao)商(shang)推出了壹種創新(xin)方(fang)法(fa)，用(yong)於放(fang)大(da) CCD 讀(du)取本底噪聲(sheng)以上的(de)微弱信(xin)號(hao)。通(tong)過集成片(pian)上(shang)倍(bei)增增益寄存器(qi)，電子(zi)倍(bei)增器(qi)件(jian) ( EMCCD ) 以低(di)得多(duo)的成本實現了增強型(xing)或電子(zi)轟(hong)擊(ji) CCD 典(dian)型(xing)的(de)單光子(zi)檢(jian)測(ce)靈敏(min)度，並且(qie)不(bu)會影響傳(chuan)統 CCD 架(jia)構(gou)的(de)量(liang)子(zi)效(xiao)率(lv)和(he)分辨率(lv)特性(xing)。 
活細胞成像(xiang)對(dui)細胞顯(xian)微鏡光學系統的要求
      針(zhen)對(dui)活細胞成像(xiang)應(ying)用的顯(xian)微鏡必(bi)須配(pei)備(bei)由(you)堅(jian)固(gu)的復(fu)合(he)材料(liao)或鋁(lv)制成的(de)高質量(liang)框架(jia)，並且(qie)應(ying)該通(tong)過牢固(gu)地安(an)裝(zhuang)在(zai)無(wu)振(zhen)動平(ping)臺(tai)上來(lai)穩(wen)定(ding)。外(wai)部(bu)光學表面(mian)以及組(zu)件(jian)外(wai)殼(ke)（聚(ju)光鏡、燈(deng)箱(xiang)、物(wu)鏡轉(zhuan)盤等(deng)）應(ying)保(bao)持清潔(jie)狀態(tai)，顯(xian)微鏡周(zhou)圍的環(huan)境(jing)應(ying)無塵(chen)且(qie)相(xiang)對濕度較低(di)。活細胞成像(xiang)持(chi)續需要(yao)的(de)常規(gui)程序(xu)之壹是使(shi)用科勒(le)照明原理(li)確保(bao)顯(xian)微鏡光學路徑和(he)光闌(lan)對齊(qi)。
     活細胞成像(xiang)較關鍵的(de)方面(mian)可(ke)能(neng)是實(shi)現(xian)較佳放(fang)大(da)倍率(lv)，同(tong)時在(zai)實(shi)驗過程中(zhong)平(ping)衡(heng)信號(hao)強度（有利於低(di)倍率(lv)）、分辨率(lv)（有(you)利(li)於更高倍(bei)率(lv)）和(he)細(xi)胞活力。研(yan)究(jiu)人員(yuan)使(shi)用時註意用盡(jin)可(ke)能(neng)少的透鏡元(yuan)件(jian)將光學放(fang)大(da)倍率(lv)與(yu)探(tan)測器(qi)的(de)像(xiang)素(su)大小相(xiang)匹配(pei)。具(ju)有多(duo)種中(zhong)間放(fang)大(da)倍數(shu)的(de)光耦(ou)合器(qi)可(ke)在(zai)市場(chang)上買(mai)到，以滿(man)足(zu)光限(xian)制和(he)高分辨率(lv)應(ying)用的特定(ding)物(wu)鏡要(yao)求（放(fang)大(da)倍率(lv)和(he)數(shu)值(zhi)孔徑）。在(zai)選擇(ze)顯(xian)微鏡物(wu)鏡放(fang)大(da)倍率(lv)時，應(ying)嚴(yan)格考慮奈(nai)奎斯(si)特分辨率(lv)標(biao)準(zhun)。

      活細胞成像(xiang)常用(yong)的標準(zhun)顯(xian)微鏡物(wu)鏡是(shi) 10x 和 40x（幹），以及 40x、60x 和(he) 100x 油(you)浸(jin)或水(shui)浸(jin)版本。經濟(ji)的(de)幹式(shi)低(di)倍率(lv)鏡頭(tou)主(zhu)要用(yong)於樣品(pin)的(de)初(chu)步(bu)掃(sao)描以定位(wei)感興(xing)趣的區(qu)域，並且(qie)不(bu)需要(yao)高光學校正(zheng)因(yin)子(zi)。而(er)浸(jin)沒(mei)透鏡應(ying)具(ju)有高數(shu)值(zhi)孔徑（油(you)為(wei) 1.3 至(zhi) 1.45，水(shui)為(wei) 1.2）和高透光效(xiao)率(lv)。由(you)於圖(tu)像(xiang)通(tong)常聚(ju)集在(zai)視(shi)場(chang)中(zhong)心(xin)附(fu)近(jin)，因(yin)此(ci)高度校正以產(chan)生(sheng)平(ping)坦視(shi)場(chang)的物(wu)鏡通(tong)常不(bu)會提(ti)供(gong)可檢(jian)測(ce)的好(hao)處(chu)，並且(qie)與(yu)校正較少的物(wu)鏡相(xiang)比，成本明顯(xian)更高且(qie)光效(xiao)更低(di)。
           冷卻單色 sCMOS 和 CCD 相(xiang)機是(shi)大多數(shu)涉(she)及(ji)培養(yang)中(zhong)活細胞的成像(xiang)應(ying)用的適(shi)宜(yi)選擇(ze)，無論是(shi)落射熒光還是具(ju)有對(dui)比度增強（DIC 和相(xiang)差）的(de)透射光是(shi)主(zhu)要采集模(mo)式(shi)。在(zai)選擇(ze)相(xiang)機時，要(yao)考慮的重(zhong)要(yao)參(can)數(shu)包括量(liang)子(zi)效(xiao)率(lv)、噪聲(sheng)水(shui)平(ping)（暗(an)電流和讀(du)數(shu)）、像(xiang)素(su)大小（以及相(xiang)關的(de)全阱(jing)容量）和(he)掃(sao)描頻率(lv)。為(wei)了盡(jin)量(liang)減(jian)少撞(zhuang)擊(ji)樣品(pin)的(de)激(ji)發光水(shui)平(ping)，相(xiang)機應(ying)盡(jin)可(ke)能(neng)靈敏(min)，這(zhe)通(tong)常意味著(zhe)高量(liang)子(zi)效(xiao)率(lv)、低(di)噪聲(sheng)、大(da)像素(su)尺寸和(he)慢掃(sao)描速(su)率(lv)。

      慢掃(sao)描 CCD 相(xiang)機的(de)幀速(su)率(lv)通(tong)常受(shou)到限制，除(chu)非(fei)樣品(pin)具(ju)有極(ji)亮(liang)的(de)熒光，否(fou)則當曝光時間(jian)短時信(xin)噪比(bi)會差。這(zhe)限(xian)制了這(zhe)些相(xiang)機系(xi)統在(zai)高速(su)成像(xiang)應(ying)用中(zhong)的使(shi)用（範(fan)圍高達(da)每秒 30 幀），並阻礙(ai)了對樣本進行聚焦(jiao)的嘗試(shi)。在(zai)定(ding)位(wei)合適(shi)的(de)標(biao)本和聚焦(jiao)相(xiang)機時，應(ying)盡(jin)量(liang)避(bi)免(mian)光漂(piao)白和(he)光毒(du)性，這(zhe)些偽影(ying)會(hui)影(ying)響細胞活力和(he)亮(liang)度。在(zai)這(zhe)方(fang)面(mian)，應(ying)選擇(ze)具(ju)有無(wu)快門、幀傳(chuan)輸(shu)的EMCCD裝(zhuang)置(zhi) 或行(xing)間(jian) CCD 傳(chuan)感器(qi)的(de)相(xiang)機，這(zhe)些傳(chuan)感器(qi)除(chu)了能(neng)夠提(ti)供(gong)慢速(su)掃(sao)描數(shu)字(zi)信號(hao)外(wai)，還能(neng)夠以視(shi)頻速(su)率(lv)提(ti)供(gong)連(lian)續(xu)的(de)圖(tu)像(xiang)流(liu)。

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