熒(ying)光素酶(mei)檢測時的註(zhu)意事(shi)項(xiang)

標(biao)簽：熒(ying)光素 細(xi)胞轉染(ran) 熒(ying)光強度(du)   熒(ying)光檢測 啟(qi)動(dong)子 

  螢火蟲(chong)可以(yi)在(zai)螢光素酶(mei)的存在下將(jiang)螢光素轉(zhuan)化(hua)為氧化螢光素以(yi)發(fa)光。利(li)用熒(ying)光素酶(mei)的較常(chang)見的科(ke)學(xue)測定是報告(gao)基(ji)因測(ce)定，其中可以通(tong)過(guo)測量來自熒(ying)光素酶(mei)反應(ying)的光信號來(lai)跟(gen)蹤(zong)轉(zhuan)錄激活(huo)或抑制(zhi)。建(jian)議(yi)使(shi)用雙(shuang)熒(ying)光素酶(mei)系統(tong)，其中發生二(er)次生物發光反應(ying)。第二(er)個(ge)信號由(you)另壹個(ge)分子發出(chu)。最常(chang)見的是由也(ye)可以(yi)生物發光的海腎基(ji)因編碼（壹(yi)些(xie)質粒(li)已(yi)經包(bao)含(han)海腎和(he)螢光素酶(mei)基(ji)因，例如(ru) Promega 的 pmirGLO）。這允(yun)許(xu)您將(jiang)熒(ying)光素酶(mei)表達標(biao)準化為(wei)對照並(bing)測(ce)量您的相對轉染(ran)效(xiao)率。

熒(ying)光素酶(mei)檢測過程中的註(zhu)意事(shi)項(xiang)：
1.信號問(wen)題(ti)：無信號或低信號。
    這(zhe)可能(neng)歸於轉(zhuan)染(ran)問(wen)題(ti)。我(wo)會(hui)先(xian)檢查妳的質粒(li)的質量。確(que)保您(nin)具(ju)有(you)轉(zhuan)染(ran)質(zhi)量(liang)的 DNA正(zheng)常(chang)的小(xiao)量(liang)制(zhi)備柱(zhu)通(tong)常會(hui)攜(xie)帶(dai)更(geng)多的內(nei)毒素和(he)鹽(yan)，這些(xie)內(nei)毒素和(he)鹽(yan)可能(neng)會(hui)抑制(zhi)您的細胞轉染(ran)或導致細(xi)胞死亡。
    有(you)些(xie)細胞難以(yi)轉染(ran)。建(jian)議(yi)對使(shi)用的每(mei)個(ge)細(xi)胞系，對 DNA 和(he)轉染(ran)試劑(ji)的量進(jin)行滴(di)定實(shi)驗(yan)。顯(xian)然(ran)，作(zuo)為(wei)您(nin)的標(biao)準化對照，使(shi)用的海腎質(zhi)粒(li)的量應始終(zhong)保持(chi)不變。
2.DNA 量：通常(chang)您(nin)要評(ping)估對照質粒(li)與實(shi)驗(yan)質粒(li)，由(you)於(yu)添(tian)加了(le)實(shi)驗(yan)序(xu)列，這(zhe)些質(zhi)粒(li)的大小(xiao)可(ke)能(neng)不同。即使(shi)您將(jiang)相同量的 DNA 轉染(ran)到(dao)每(mei)個(ge)孔(kong)中，每(mei)個(ge)孔(kong)獲(huo)得的 DNA 總(zong)量也(ye)可能(neng)不同，因為(wei)您(nin)轉染(ran)的摩爾(er)比不同。
例如(ru)：
來(lai)自 2000 bp 質粒(li)的 1 µg DNA 是 0.76 pmoles DNA
來自 3000 bp 質粒(li)的 1 µg DNA 是 0.51 pmoles DNA。
較大的質粒(li)每(mei)克含(han)有(you)較少(shao)的 DNA 摩爾(er)數(shu)！因此，您需要轉染(ran)更(geng)大質(zhi)粒(li)的更(geng)多 DNA，才能(neng)轉染(ran)與小(xiao)質(zhi)粒(li)相同數(shu)量的 DNA。為了使(shi)轉染(ran)的 DNA 量標(biao)準化，許(xu)多人(ren)使(shi)用“填(tian)充"DNA，例如(ru) pUC19 質(zhi)粒(li)（在(zai)哺(bu)乳動(dong)物細胞中沒有功能(neng)）。
例如(ru)，要測試不同數(shu)量的熒(ying)光素酶(mei)質粒(li)但保持(chi)總(zong) DNA 相同，您可(ke)以(yi)執行以下操作(zuo)：

3.時(shi)間：您(nin)可能(neng)錯過了(le)可視(shi)化效果(guo)的窗(chuang)口(kou)。細(xi)胞通常(chang)在轉染(ran)後(hou) 24 – 48 小(xiao)時(shi)進(jin)行檢測，但這在很大程度(du)上(shang)取(qu)決於(yu)細胞機器表達您(nin)感興趣(qu)的基(ji)因所(suo)需的時間。可(ke)以(yi)以(yi)優化(hua)轉(zhuan)染(ran)後(hou)孵(fu)育(yu)時間(jian)的時間過(guo)程來(lai)決(jue)定檢測細胞的合適(shi)時(shi)間(jian)點(dian)。
4.信號太(tai)強：飽和(he)度：雖然(ran)高(gao)的信號可(ke)能(neng)被視(shi)為陽性(xing)，但您還需要確(que)保您(nin)處於檢測和(he)光度計(ji)的動(dong)態範(fan)圍內(nei)，並(bing)且(qie)不會(hui)使(shi)信號飽和(he)。如果您(nin)有(you)較高(gao)的值，則您(nin)可(ke)能(neng)使(shi)用了(le)過多的 DNA。
啟(qi)動(dong)子強度(du)：此外，您(nin)可能(neng)需要更(geng)改(gai)質粒(li)。如(ru)果(guo)您(nin)使(shi)用非(fei)常強的啟(qi)動(dong)子，例如(ru) CMV 或 SV40，這也(ye)可能(neng)會(hui)使(shi)您的信號飽和(he)。某(mou)些(xie)應(ying)用（例如(ru)，如(ru)果您(nin)正(zheng)在(zai)測(ce)量(liang) miRNA 阻(zu)斷(duan)結合(he)位點(dian)的能(neng)力(li)）需要較弱(ruo)的啟(qi)動(dong)子，因為(wei)您所(suo)看(kan)到(dao)的效果可(ke)能(neng)比轉錄(lu)阻(zu)遏(e)元(yuan)件的效果非(fei)常(chang)輕(qing)微。

重復之(zhi)間的差(cha)異(yi)：
同壹實(shi)驗(yan)的孔(kong)之(zhi)間(jian)的差(cha)異(yi)表現(xian)在(zai)：
1.移(yi)液：孔(kong)獲(huo)得的液體(ti)量的微小(xiao)變(bian)化(hua)會(hui)極(ji)大地(di)影響轉(zhuan)染(ran)和(he)熒(ying)光素酶(mei)測定的執行方式(shi)。熒(ying)光素酶(mei)檢測對此較為(wei)敏感！建(jian)議(yi)為(wei)您(nin)的轉染(ran)反(fan)應(ying)制(zhi)作預(yu)混(hun)液（即(ji)使(shi)它只(zhi)是用於重復的 3 個孔(kong)）。對於每(mei)個(ge)組(zu)合，您應(ying)該始終(zhong)至少有 2 次重復，最好(hao)是 3 次。
2.酶(mei)標(biao)板：另(ling)壹個問(wen)題(ti)可(ke)能(neng)是妳的酶(mei)標(biao)板。來(lai)自相鄰孔(kong)的背景發光會(hui)幹(gan)擾您的實(shi)驗(yan)。建(jian)議(yi)您(nin)在(zai)白壁(bi)或不透明板中進(jin)行熒(ying)光素酶(mei)檢測。但是，您無法(fa)在(zai)白(bai)色(se)孔(kong)板(ban)中看(kan)到(dao)您(nin)的細胞，因為(wei)它們是*白色(se)的！
3.實(shi)驗(yan)之間的變異(yi)（生物變異(yi)）
    應(ying)該重復多(duo)次實(shi)驗(yan)，以確(que)保您(nin)測量的效果是可重復的，因此有(you)可(ke)能(neng)與生物學相關。然(ran)而(er)，我們(men)註(zhu)意到(dao)細(xi)胞進(jin)行轉(zhuan)染(ran)的能(neng)力(li)在(zai)很(hen)大程度(du)上(shang)取(qu)決於(yu)它們的匯(hui)合度(du)，尤其是貼(tie)壁(bi)細胞。轉染(ran)依(yi)賴於細(xi)胞表面接(jie)觸(chu)，過度(du)融(rong)合的細胞可能(neng)轉染(ran)效(xiao)率較低。不要假設如果您(nin)接(jie)種相同數(shu)量的細胞，它們(men)每(mei)次都會(hui)以(yi)相同的方式(shi)沈(chen)澱(dian)在板(ban)的底部！從(cong)而(er)致使(shi)細胞結塊(kuai)。嚴重地(di)影響您(nin)細(xi)胞的轉染(ran)效(xiao)率和(he)熒(ying)光素酶(mei)的檢測結果。