T細(xi)胞(bao)檢測方法(fa)有哪(na)些？

由(you)於(yu)T細(xi)胞(bao)具(ju)有多(duo)種(zhong)亞(ya)型(xing)，所以(yi)研(yan)究(jiu)膜(mo)結(jie)合T細(xi)胞(bao)受體(ti)的(de)技術困難，但(dan)在(zai)某(mou)些情況(kuang)下，您(nin)希(xi)望(wang)能(neng)夠做(zuo)到(dao)這(zhe)壹(yi)點(dian)，例如(ru)分(fen)析(xi)哪(na)些免疫(yi)記(ji)憶(yi)已被誘(you)導以測量個(ge)體(ti)對(dui)特定抗原的(de)反應(ying)程度。此時， 有多(duo)種(zhong)方法(fa)可以(yi)實現，主要分為兩大(da)類(lei)：壹(yi)種(zhong)是(shi)通過測(ce)量(liang)特征(zheng)性(xing)反(fan)應(ying)（例(li)如(ru)細(xi)胞(bao)因子分(fen)泌(mi)）來檢測 T 細(xi)胞(bao)對刺激(ji)作(zuo)出(chu)反應(ying)的(de)激活，另(ling)壹(yi)種(zhong)是(shi)通過細(xi)胞(bao)的(de)特異(yi)性(xing)來分析(xi)T細(xi)胞(bao)受體(ti)。

下面總(zong)結(jie)了壹(yi)下 T細(xi)胞(bao)分析(xi)的(de)6種(zhong)方法(fa)：
1. 限(xian)制(zhi)稀(xi)釋(shi)培(pei)養(yang)
該(gai)技(ji)術涉(she)及通過使用(yong)不同稀(xi)釋(shi)度(du)的(de)細(xi)胞(bao)來測量對(dui)特定抗原產(chan)生(sheng)反(fan)應(ying)的(de) T 細(xi)胞(bao)的(de)頻率(lv)，然(ran)後(hou)測(ce)量無(wu)反(fan)應(ying)的(de)孔(kong)數(shu)。
不用(yong)過多(duo)計算(suan)，簡而(er)言(yan)之，每(mei)個(ge)孔(kong)中(zhong)活性(xing) T細(xi)胞(bao)的(de)分布(bu)應(ying)遵循泊松(song)分(fen)布隨機(ji)分布(bu)原(yuan)則(ze)。我們可(ke)以使用(yong)這(zhe)些信息(xi)來計算(suan)我們擁(yong)有的(de)活躍 T 細(xi)胞(bao)的(de)數(shu)量。從(cong)泊松(song)分(fen)布中(zhong)我們知(zhi)道，如果(guo)反應(ying)陰(yin)性(xing)的(de)孔(kong)比例(li)為(wei) 37%，那(na)麽(me)每(mei)個(ge)孔(kong)中(zhong)平均有壹(yi)個抗原特異(yi)性(xing) T 細(xi)胞(bao)。因此讀(du)取(qu)產(chan)生(sheng) 37% 陰(yin)性(xing)孔(kong)的(de)細(xi)胞(bao)數(shu)，然後(hou)我們可(ke)以計算(suan)響(xiang)應(ying)細(xi)胞(bao)的(de)頻率(lv)。例(li)如(ru)，如(ru)果(guo)以每(mei)孔(kong) 5000 個細(xi)胞(bao)接(jie)種(zhong)細(xi)胞(bao)導致 37% 的(de)細(xi)胞(bao)呈陰性(xing)，我們知(zhi)道我們有(you) 1/5000 個活躍細(xi)胞(bao)的(de)頻率(lv)。啟動或免疫(yi)小(xiao)鼠(shu)後，頻(pin)率(lv)相(xiang)應(ying)增(zeng)加(jia)，就(jiu)表(biao)明(ming)抗原正在(zai)驅(qu)動增殖。
2. ELISPOT
如果(guo)需要(yao)對(dui)細(xi)胞(bao)進行表型(xing)分析(xi)，有(you)限(xian)稀(xi)釋(shi)培(pei)養(yang)法(fa)就(jiu)顯得(de)費力些。此時可以(yi)可(ke)以通過細(xi)胞(bao)因子的(de)產(chan)生(sheng)來測量 T 細(xi)胞(bao)的(de)反應(ying)，即(ji)：ELISPOT（酶(mei)聯免疫(yi)斑(ban)點(dian)）進行檢測(ce)。
方法(fa)步驟如下：在(zai)使用(yong)非(fei)反(fan)應(ying)性(xing)血(xue)清(qing)進行封(feng)閉(bi)之(zhi)前，可以(yi)在(zai) PVDF（聚(ju)偏(pian)二(er)氟乙(yi)烯）覆蓋的(de)微(wei)孔(kong)板(ban)上塗上單克(ke)隆(long)或多(duo)克(ke)隆(long)抗體(ti)，並將(jiang)板(ban)上的(de) T 細(xi)胞(bao)與壹(yi)種(zhong)或多(duo)種(zhong)物(wu)質(zhi)壹(yi)起培養(yang)以(yi)激(ji)活細(xi)胞(bao)因子的(de)分泌(mi)。然(ran)後(hou)細(xi)胞(bao)因子被(bei)包(bao)被(bei)的(de)抗體(ti)捕(bu)獲。接(jie)下來，在(zai)添(tian)加(jia)二(er)抗之前清洗(xi)板(ban)以去除(chu)碎(sui)片、未(wei)結(jie)合的(de)抗體(ti)和(he)培養(yang)基(ji)，二(er)抗與顯(xian)色（著(zhe)色）底物(wu)（通常(chang)是(shi)帶(dai)有辣(la)根(gen)過氧(yang)化物(wu)酶(mei)或堿性(xing)磷酸酶(mei)的(de)鏈黴(mei)親(qin)和素）偶聯，然(ran)後再(zai)次(ci)洗滌(di)。然後，您(nin)可(ke)以(yi)將(jiang)目(mu)的(de)細(xi)胞(bao)因子視(shi)為(wei)可見點(dian)，並分別(bie)使用(yong)顯(xian)微(wei)鏡手動(dong)或自動使用(yong)自動閱(yue)讀(du)器(qi)對(dui)其進行計數(shu)。這(zhe)種(zhong)方法(fa)的(de)缺點(dian)在(zai)於(yu) 雖然量化(hua)產(chan)生(sheng)抗體(ti)的(de) T 細(xi)胞(bao)的(de)數(shu)量方面(mian)相(xiang)對較(jiao)多(duo)，但(dan)在(zai)描(miao)述(shu)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)的(de)細(xi)胞(bao)因子產(chan)生(sheng)譜(pu)時仍然(ran)受到限(xian)制(zhi)。
3. 細(xi)胞(bao)內染色
細(xi)胞(bao)內染色是(shi)指在(zai)固(gu)定和(he)透化細(xi)胞(bao)之前用(yong)蛋白質(zhi)轉運抑制(zhi)劑(ji)（例如莫(mo)能菌(jun)素(su)或布雷(lei)菲(fei)爾德菌(jun)素(su)）處(chu)理來抑制(zhi)細(xi)胞(bao)因子的(de)分泌(mi)，並針對您(nin)的(de)細(xi)胞(bao)因子的(de)熒光(guang)標記(ji)抗體(ti)，並通過流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)術進行測量(liang)的(de)方法(fa)。其缺點(dian)在(zai)於(yu)會殺死(si)細(xi)胞(bao) 。
4. 細(xi)胞(bao)因子捕(bu)獲(huo)
細(xi)胞(bao)因子捕(bu)獲(huo)法的(de)原理(li)是(shi)來自不同抗體(ti)的(de)兩個(ge)重(zhong)鏈(lian)和(he)輕鏈對(dui)組(zu)合在(zai)壹(yi)起，得(de)到帶(dai)有兩(liang)個不同配體(ti)的(de)兩個(ge)抗原結(jie)合位點(dian)的(de)雜交(jiao)抗體(ti)。這(zhe)些雙特異(yi)性(xing)抗體(ti)可(ke)用(yong)於(yu)檢測細(xi)胞(bao)因子。壹(yi)種(zhong)配體(ti)是(shi) T 細(xi)胞(bao)特異(yi)的(de)標記(ji)物(wu)，另(ling)壹(yi)種(zhong)是(shi)目標細(xi)胞(bao)因子特異(yi)的(de)標記(ji)物(wu)。活化(hua)的(de) T 細(xi)胞(bao)用(yong)蛋白質(zhi)轉運抑制(zhi)劑(ji)處理，因此細(xi)胞(bao)因子在(zai)細(xi)胞(bao)內積(ji)累(lei)。然(ran)後(hou)使用(yong)雜(za)交(jiao)抗體(ti)來捕獲和(he)檢測 T 細(xi)胞(bao)表面標記(ji)的(de)細(xi)胞(bao)因子。甲雜交(jiao)抗體(ti)可(ke)用(yong)於(yu)執行此操(cao)作(zuo)。雜(za)交(jiao)抗體(ti)由(you)對目標細(xi)胞(bao)因子和(he)常(chang)見細(xi)胞(bao)表面蛋白（如(ru) MHC I 類(lei)）特異(yi)的(de)抗體(ti)制(zhi)成。雜(za)交(jiao)抗體(ti)結(jie)合活化(hua)的(de) T 細(xi)胞(bao)。如果(guo) T 細(xi)胞(bao)分泌細(xi)胞(bao)因子，則(ze)與(yu)細(xi)胞(bao)表面結(jie)合的(de)雜交(jiao)抗體(ti)會(hui)捕獲(huo)它們。然後使用(yong)針對目(mu)標細(xi)胞(bao)因子的(de)標記(ji)二(er)抗檢測(ce)分泌(mi)細(xi)胞(bao)因子的(de) T 細(xi)胞(bao)。
5. 四(si)聚體(ti)染(ran)色
T 細(xi)胞(bao)反應(ying)也(ye)可(ke)以通過其(qi)受體(ti)的(de)特異(yi)性(xing)來測量，使用(yong)熒(ying)光(guang)標記(ji)的(de)四(si)聚體(ti)或特定的(de) MHC：肽(tai)復(fu)合物(wu)。MHC ：肽(tai)四(si)聚體(ti)由(you)重(zhong)組(zu) MHC 分子(zi)制(zhi)成，其(qi)中(zhong)特定肽(tai)與(yu)生(sheng)物(wu)素(su)-鏈黴(mei)親(qin)和素結(jie)合。表(biao)達(da)相(xiang)應(ying)特異(yi)性(xing)的(de) T 細(xi)胞(bao)結(jie)合這(zhe)些四(si)聚體(ti)。然(ran)後對(dui)這(zhe)些進行染色以(yi)進行檢測(ce)，並可以(yi)通過流(liu)式(shi)細(xi)胞(bao)術進行分析(xi)！
6. 光(guang)譜(pu)分(fen)析(xi)和(he)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)檢(jian)測
T細(xi)胞(bao)群的(de)多(duo)樣(yang)性可以(yi)通過光(guang)譜(pu)分(fen)析(xi)來定義(yi)。在(zai)這(zhe)裏(li)，CDR3 區域通過凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳可(ke)視(shi)化，讓(rang)您(nin)可(ke)以(yi)比(bi)較(jiao)表(biao)達(da)相(xiang)同 V 段(duan)的(de)受體(ti)。然(ran)後可(ke)以使用(yong)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)測(ce)定來測量配體(ti)與(yu)其互(hu)補(bu)抗原受體(ti)的(de)結(jie)合和(he)解(jie)離率(lv)。
待(dai)測(ce)配體(ti)固(gu)定在(zai)鍍(du)金(jin)表(biao)面(mian)。然後使可溶(rong)性 T 細(xi)胞(bao)受體(ti)與(yu)結(jie)合的(de)配體(ti)接(jie)觸(chu)並結(jie)合。壹(yi)段(duan)時間後(hou)，他(ta)們分(fen)離(li)。可以使用(yong)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)實(shi)時測量(liang)發(fa)生這(zhe)種(zhong)情況(kuang)的(de)速(su)率(lv)。附著(zhe)和脫離(li)的(de)速(su)率(lv)由(you)生物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)監測，該(gai)生(sheng)物(wu)傳(chuan)感(gan)器(qi)可(ke)以有效(xiao)進行全內反射並 結(jie)合對(dui)玻(bo)璃芯片表面(mian)偏振(zhen)光源的(de)影響(xiang)來測量鍍(du)金(jin)玻(bo)璃芯片表面(mian)分子(zi)的(de)結(jie)合. 它(ta)檢(jian)測(ce)反(fan)射光(guang)束(shu)的(de)角度(du)和(he)強(qiang)度(du)的(de)任何(he)波動(dong)，並將(jiang)其(qi)與(yu)時間繪制(zhi)成圖(tu)以(yi)創建“傳感(gan)圖" 。
也(ye)可(ke)以結(jie)合受體(ti)而(er)不是(shi)配體(ti)。當系(xi)統(tong)飽和(he)或達到(dao)結(jie)合和(he)解(jie)離之(zhi)間的(de)平衡狀(zhuang)態時，達到(dao)最大(da)結(jie)合後(hou)，曲(qu)線將(jiang)趨(qu)於(yu)穩(wen)定，表(biao)明(ming)不再發生(sheng)結(jie)合。然(ran)後(hou)可(ke)以(yi)洗(xi)掉未(wei)結(jie)合的(de)分子(zi)，在(zai)繼(ji)續(xu)洗(xi)滌後(hou)，它(ta)們(men)都(dou)開始從它(ta)們(men)結(jie)合的(de)蛋白質(zhi)上脫落。測(ce)量相(xiang)互作(zuo)用(yong)的(de)曲線將(jiang)開(kai)始下降，顯(xian)示(shi)發生(sheng)解(jie)離的(de)速(su)率(lv)。
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