使用(yong)EBV 表達(da)細胞(bao)轉(zhuan)化(hua)淋(lin)巴細胞(bao)的(de)方法(fa)？

EBV，也稱為人(ren)類(lei)皰疹病(bing)毒(du) 4，是淋巴隱(yin)病(bing)毒(du)屬的(de)壹種伽馬皰(pao)疹病(bing)毒(du). 它(ta)是(shi)傳染(ran)性單(dan)核細胞(bao)增多(duo)癥(zheng)的(de)原因，並(bing)與(yu)多(duo)種人(ren)類(lei)腫瘤(liu)疾病(bing)有(you)關，包(bao)括(kuo)伯(bo)基(ji)特(te)淋巴瘤(liu)和霍(huo)奇(qi)金(jin)淋(lin)巴瘤(liu)。大多(duo)數(shu)成年(nian)人(ren)的(de) EBV 血清(qing)反應呈(cheng)陽性，表明其在(zai)人(ren)群(qun)中(zhong)普遍存(cun)在(zai)。感染(ran)通常是(shi)潛(qian)伏的(de)。然而(er)，外(wai)植的(de)淋巴瘤(liu)細胞(bao)有(you)時(shi)會產生(sheng)傳染(ran)性病(bing)毒(du)。幾十年(nian)前(qian)，來自淋(lin)巴瘤(liu)外(wai)植體(ti)的(de)細胞(bao)系的(de)上(shang)清(qing)液被(bei)用(yong)於確(que)認 EBV 感(gan)染(ran)的(de)腫瘤(liu)潛(qian)力，這(zhe)是通(tong)過病(bing)毒(du)介導(dao)的(de)細胞(bao)培(pei)養中(zhong)人(ren)血(xue) B 淋巴細胞(bao)的(de)永生(sheng)化(hua)。從(cong)那(na)時(shi)起，B 淋巴細胞(bao)的(de) EBV 體(ti)外(wai)轉(zhuan)化(hua)已(yi)成(cheng)為(wei)獲得用於(yu)診斷(duan)和(he)研(yan)究人(ren)類(lei)細胞(bao)系的(de)常規(gui)程(cheng)序(xu)。

壹、實(shi)驗(yan)材料的(de)準備(bei)：

1.二(er)甲(jia)基(ji)亞(ya)碸(feng) (DMSO)

2. 培(pei)養基(ji)

 IMDM、RPMI-1640、胎牛(niu)血清(qing)

3.抗生(sheng)素

青黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素溶(rong)液，10,000 IU/mL 青(qing)黴(mei)素，10,000 μg/mL 鏈(lian)黴(mei)素 ( ATCC 30-2300 )

4.PBS緩(huan)沖液，不(bu)含鈣(gai)和鎂

5.來自 EBV 表達(da)細胞(bao)的(de)過濾(lv)上(shang)清(qing)液

6.經輻照(zhao)的(de) MRC-5 貼壁細胞(bao)

註(zhu)意：經輻照(zhao)的(de) MRC-5 細胞(bao)包裝(zhuang)為(wei)冷(leng)凍(dong)懸(xuan)浮液，每(mei)瓶 1 毫(hao)升。每(mei)個小瓶足(zu)以接(jie)種高達(da) 225 cm 2的(de)表面積（9 - T-25 燒(shao)瓶）

二(er)、生(sheng)物實(shi)驗(yan)器材的(de)準備(bei)

凍(dong)存(cun)管(guan)

去纖維蛋(dan)白(bai)或抗凝劑(ji)處理(li)的(de)全(quan)人(ren)血(xue)

Histopaque-1077 Ficoll 梯度(du)溶液或Sigma-Aldrich 

25 cm 2 (T-25) 細胞(bao)培(pei)養瓶，細胞(bao)培(pei)養處(chu)理

75 cm 2 (T-75) 細胞(bao)培(pei)養瓶，細胞(bao)培(pei)養處(chu)理

15 mL 無(wu)菌聚苯(ben)乙(yi)烯離心(xin)管，帶蓋(gai)

實(shi)驗(yan)目的(de)：使用(yong)EBV 制(zhi)劑(ji) 轉(zhuan)化(hua)您的(de)B 淋巴細胞(bao)從而(er)獲得 VR-1492。

實(shi)驗(yan)時(shi)的(de)註(zhu)意事項：

所有(you)工作(zuo)都應在(zai) BSL-2 條(tiao)件下(xia)使用(yong)無(wu)菌技(ji)術完(wan)成(cheng)，並(bing)使(shi)用(yong)處(chu)理(li)血液制(zhi)品的(de)通用(yong)預(yu)防措施。B95-8 細胞(bao)還可能攜帶和(he)分泌壹(yi)種可傳播的(de) D 型逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)，松鼠猴逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du) – B95-8 (SMRV-B95-8)，它(ta)可以感(gan)染(ran)人(ren)類(lei) B 和 T 細胞(bao)系。這(zhe)種逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)病(bing)毒(du)不(bu)會(hui)幹(gan)擾(rao) EBV 的(de)轉(zhuan)化(hua)能力。

實(shi)驗(yan)步驟(zhou)：

1.將(jiang) 0.1 mL DMSO 分配(pei)到(dao)標(biao)記(ji)的(de)冷凍(dong)管中用(yong)於(yu)血液儲(chu)存(cun)。

2.從(cong)容(rong)器(qi)中(zhong)匯(hui)集去纖(xian)維蛋(dan)白(bai)或抗凝劑(ji)處理(li)過的(de)血液。

3.每(mei)個(ge)凍(dong)存(cun)管(guan)分配(pei) 0.9 mL 的(de)血液，定(ding)期(qi)混(hun)合(he)以確(que)保(bao)均勻的(de)細胞(bao)懸(xuan)浮液。蓋(gai)上(shang)小(xiao)瓶並(bing)輕(qing)輕(qing)混(hun)合(he)。

4.在(zai) -80°C 的(de)乙(yi)醇(chun)中將(jiang)小瓶冷(leng)凍(dong)在(zai)冷凍(dong)保(bao)存(cun)容(rong)器(qi)中(zhong) 3-18 小(xiao)時(shi)，或以每(mei)分鐘(zhong) 1°C 的(de)速(su)度(du)冷凍(dong)。

5.將(jiang)冷凍(dong)保(bao)存(cun)的(de)血液小(xiao)瓶儲(chu)存(cun)在(zai)液氮中。

6.在(zai)用於(yu)轉(zhuan)化(hua)前(qian) 1-5 天(tian)準(zhun)備(bei)飼(si)養層(ceng)。

7.通過將(jiang) FBS 添加到(dao) EMEM 或 IMDM 到(dao) 10% v/v 和(he)青(qing)黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素溶(rong)液到(dao) 1% v/v (1X) 來制(zhi)備(bei)完(wan)整(zheng)的(de)培(pei)養基(ji)。

8.解(jie)凍(dong)壹瓶經輻照(zhao)的(de) MRC-5 單層(ceng)細胞(bao)，並(bing)在(zai)無(wu)菌 50 mL 錐(zhui)形(xing)管中(zhong)與 27 mL 完(wan)整(zheng)培(pei)養基(ji)混(hun)合(he)。

9.每個(ge) T-25 燒(shao)瓶（~4 × 10 5 個(ge)  細胞(bao)）分配(pei) 3 mL 細胞(bao)懸(xuan)浮液。 

10.第(di)二(er)天(tian)用(yong)顯(xian)微(wei)鏡檢(jian)查培(pei)養瓶。理(li)論上(shang)應該(gai)是大(da)約(yue) 30% 重(zhong)合(he)。

註(zhu)意：培(pei)養後(hou)1-5天(tian)用(yong)於(yu)轉(zhuan)化(hua)。

淋(lin)巴細胞(bao)處理(li)步驟(zhou)：

1.準備(bei)用(yong)於(yu)轉(zhuan)化(hua)的(de)淋巴細胞(bao)

2.將(jiang) 3 mL 的(de)全(quan)血(xue)（新鮮(xian)或解(jie)凍(dong)）與等體(ti)積的(de) PBS 或 RPMI-1640 混(hun)合(he)。

3.使用(yong) Ficoll 從紅(hong)細胞(bao)和粒(li)細胞(bao)中分(fen)離(li)淋(lin)巴細胞(bao)。

4.在(zai) 15 mL 聚苯(ben)乙(yi)烯離心(xin)管中(zhong)，將(jiang)稀釋的(de)全(quan)血(xue)小心(xin)地鋪在(zai) 4.5 mL 的(de)室溫 Histopaque-1077 上(shang)。

5.在(zai)室溫下(xia)以 400 × g 離(li)心(xin) 40 分鐘(zhong)。

6.取出並(bing)丟(diu)棄(qi)上(shang)層(ceng)透明等離(li)子(zi)層(ceng)，使(shi)其(qi)距離(li)中(zhong)間(jian)層0.3 cm 2以(yi)內。

7.將(jiang)中間層(ceng)的(de)不(bu)透(tou)明淋巴細胞(bao)帶和(he) Histopaque-1077 層轉(zhuan)移到(dao)管(guan)底(di)部(bu)顆(ke)粒的(de)0.3 cm 2 內，轉(zhuan)移到(dao)新的(de) 15 mL 離心(xin)管中(zhong)。

8.用含 20% FBS 和(he)青(qing)黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素的(de) IMDM 填(tian)充(chong)管(guan)；將(jiang)試管充(chong)分(fen)混(hun)合(he)並(bing)以(yi) 260 × g 離(li)心(xin) 15 分鐘(zhong)。取出並(bing)丟(diu)棄(qi)上(shang)清(qing)液

9.用(yong) 10% FBS 和(he)青黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素在(zai) 10 mL IMDM 中重(zhong)新懸(xuan)浮細胞(bao)顆粒(li)；以(yi) 260 × g 離(li)心(xin) 15 分鐘(zhong)，混(hun)合(he)並(bing)收集細胞(bao)。取出並(bing)丟(diu)棄(qi)上(shang)清(qing)液。

10.用(yong) 10% FBS 和(he) 1X 青黴(mei)素 /鏈(lian)黴(mei)素在(zai) 3 mL IMDM 中重(zhong)新懸(xuan)浮細胞(bao)顆粒(li)。

11.使(shi)用(yong)染(ran)料排除方(fang)法(fa)對所(suo)得淋巴細胞(bao)制(zhi)劑(ji)進行(xing)可行計(ji)數(shu)。

12.立即(ji)使(shi)用(yong)細胞(bao)進行(xing)轉(zhuan)化(hua)或將(jiang)它(ta)們(men)冷凍(dong)以備(bei)將(jiang)來用於(yu)全(quan)血(xue)。

三(san)、設置轉(zhuan)化(hua)培(pei)養物（建議每個(ge)樣(yang)品使用 2 個(ge)培(pei)養瓶） 

1.每(mei)個轉(zhuan)化(hua)瓶解(jie)凍(dong) 1 瓶人(ren)類(lei) gammaherpesvirus 4 (HHV-4) ( VR-1492) (1 mL) 。 

2.從飼(si)養層(ceng)中取(qu)出培(pei)養基(ji)。

3.  每瓶需(xu)要添(tian)加：2 毫(hao)升 IMDM 與(yu) 20% FBS；1 mL 淋巴細胞(bao)懸(xuan)液，含有(you) 1-6 × 10 6淋巴細胞(bao)；1 毫(hao)升（1 瓶）人(ren)伽馬皰(pao)疹病(bing)毒(du) 4 (HHV-4) (ATCC VR-1492)。

4.在(zai) 5% CO 2濃(nong)度(du)下(xia)， 37°C 混(hun)合(he)培(pei)養，持(chi)續觀(guan)察(cha)轉(zhuan)化(hua)細胞(bao)的(de)培(pei)養物

5.啟動(dong)後 7 天(tian)，觀(guan)察(cha)每(mei)個(ge)燒(shao)瓶的(de)轉(zhuan)化(hua)跡(ji)象(xiang)並(bing)添(tian)加(jia) 4 mL 新鮮(xian)培(pei)養基(ji)（ IMDM，含 20% FBS 和(he) 1X 青(qing)黴(mei)素/ 鏈(lian)黴(mei)素）。

6.淋(lin)巴細胞(bao)轉(zhuan)化(hua)的(de)早期(qi)跡(ji)象(xiang)包(bao)括(kuo)錐(zhui)形細胞(bao)、具(ju)有(you)尖峰狀(zhuang)突(tu)起的(de)細胞(bao)和具(ju)有(you)折(zhe)射(she)性的(de)、看(kan)起(qi)來健(jian)康(kang)的(de)細胞(bao)簇。

7.轉(zhuan)化(hua)的(de)後期(qi)跡(ji)象(xiang)包(bao)括(kuo)培(pei)養物的(de)濁度(du)增加(jia)和(he)培(pei)養基(ji)的(de)酸化(hua)，表現(xian)為變(bian)黃(huang)。

8.此(ci)後每 3-4 天(tian)，檢(jian)查培(pei)養物是否有(you)轉(zhuan)化(hua)跡(ji)象(xiang)並(bing)添(tian)加(jia)新鮮(xian)培(pei)養基(ji)。

9.小心(xin)地取(qu)出 3-4 毫(hao)升培(pei)養基(ji)而不(bu)去(qu)除細胞(bao)。

10.加回(hui)相(xiang)同(tong)體(ti)積的(de)*培(pei)養基(ji)（含 20% FBS 和(he) 1X 青(qing)黴(mei)素 /鏈(lian)黴(mei)素的(de) IMDM）。

11.擴大(da)轉(zhuan)化(hua)培(pei)養物以建立淋巴母(mu)細胞(bao)系

12.將(jiang)細胞(bao)從密(mi)集的(de) T-25 搖(yao)瓶瓶轉(zhuan)移到(dao) T-75 搖(yao)瓶，並(bing)添(tian)加(jia)足(zu)夠的(de) IMDM 和 10% FBS 和(he)青(qing)黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素，以(yi)獲得每毫(hao)升 1-3 × 10 5細胞(bao)的(de)細胞(bao)密(mi)度(du)。

13.通過添(tian)加(jia)培(pei)養基(ji)，將(jiang) T-75 搖(yao)瓶中(zhong)的(de)細胞(bao)密(mi)度(du)保(bao)持(chi)在(zai)每毫(hao)升1-3 × 10 5 個(ge)細胞(bao)。

14.擴展到(dao)額(e)外(wai)的(de)燒(shao)瓶以(yi)將(jiang)細胞(bao)密(mi)度(du)保(bao)持(chi)在(zai) 1-3 × 10 5細胞(bao)/mL。

15.以每(mei)毫(hao)升3-5 × 10 6 個(ge)細胞(bao)的(de)速(su)度(du)冷凍(dong)轉(zhuan)化(hua)細胞(bao)以供保(bao)存(cun)和(he)以後使用

16.完(wan)成(cheng)活細胞(bao)計(ji)數(shu)以確(que)定(ding)懸(xuan)浮液中(zhong)細胞(bao)的(de)密(mi)度(du)和活(huo)力(li)以(yi)及保(bao)留(liu)待(dai)冷(leng)凍(dong)的(de)細胞(bao)總(zong)數(shu)。

17.通過以(yi) 260 × g 離(li)心(xin) 15 分鐘(zhong)從培(pei)養液中(zhong)收集細胞(bao)。

18.丟棄(qi)上(shang)清(qing)液並(bing)將(jiang)細胞(bao)顆粒(li)重(zhong)新懸(xuan)浮在(zai)壹定(ding)體(ti)積的(de)冷凍(dong)冷凍(dong)介質(zhi)中（IMDM，含 10% FBS 、青(qing)黴(mei)素/鏈(lian)黴(mei)素和(he) 10% DMSO），細胞(bao)密(mi)度(du)為每(mei)毫(hao)升3-5 × 10 6 個(ge)細胞(bao)。

19.將(jiang)產生(sheng)的(de)細胞(bao)懸(xuan)浮液分(fen)配(pei)到(dao)標(biao)記(ji)的(de)冷凍(dong)管中。

20.將(jiang)小瓶在(zai)乙(yi)醇(chun)中的(de)冷凍(dong)保(bao)存(cun)容(rong)器(qi)中(zhong)在(zai) -80°C 下(xia)冷凍(dong) 3-18 小時(shi)，或以每(mei)分鐘(zhong) 1°C 的(de)速(su)度(du)在(zai)受(shou)控(kong)速(su)率冰(bing)箱(xiang)中冷(leng)凍(dong)，然後將(jiang)它(ta)們(men)儲存(cun)在(zai)液氮中。

蘇州阿爾法(fa)生(sheng)物十三(san)年(nian)專註(zhu)於生(sheng)命科(ke)學(xue)領域(yu)實(shi)驗(yan)室設備(bei)及(ji)實(shi)驗(yan)室耗材和(he)試劑(ji)供應，包(bao)括(kuo)振(zhen)蕩培(pei)養箱(xiang)、生(sheng)物反應器(qi)、移液器(qi)、離(li)心(xin)機、顯(xian)微(wei)鏡等(deng)，集實(shi)驗(yan)室設計(ji)規(gui)劃(hua)、實(shi)驗(yan)室儀器(qi)設備(bei) 、生(sheng)物實(shi)驗(yan)器材 供應、售後(hou)服(fu)務為壹體(ti)的(de)壹站(zhan)式(shi)供應商(shang)，大量(liang)現(xian)貨供應、使(shi)您的(de)實(shi)驗(yan)室采(cai)購(gou)更加方便快(kuai)捷。