實(shi)例應(ying)用：MDCK細胞的(de)生(sheng)物反應(ying)器(qi)微載體培(pei)養方(fang)法

MDCK細胞屬於(yu)動(dong)物細胞壹(yi)般(ban)采用Cytodex 作(zuo)為(wei)微載體Cytodex 主(zhu)要(yao)有兩(liang)個系列(lie) 即：Cytodex 和 Cytopore ，其中(zhong) Cytodex 1適合大多(duo)數(shu)的(de)貼壁(bi)細胞。

采(cai)用(yong)Cytodex 微載體的(de)優勢(shi)主要(yao)有以下(xia)幾點(dian)：

1. Cytodex 微(wei)載體的(de)表面(mian)比較(jiao)適(shi)宜細胞的(de)粘附(fu)和延展(zhan)。

2. 優化後(hou)的(de)大小(xiao)和密度(du)對(dui)於(yu)細胞懸(xuan)浮(fu)較(jiao)為(wei)有利(li)，適宜細胞的(de)生(sheng)長和(he)高(gao)產(chan)。

3. 這(zhe)類(lei)細胞的(de)細胞基(ji)質(zhi)具有壹(yi)定(ding)的(de)生(sheng)物惰性(xing)，可(ke)以減(jian)少(shao)攪拌(ban)培(pei)養過程(cheng)中(zhong)的(de)剪切力損害(hai)。

4. Cytodex 微載體具有較(jiao)好(hao)的(de)可放大性(xing)。試(shi)驗證(zheng)明(ming)，良好(hao)的(de)培(pei)養環境下(xia)采(cai)用(yong)搏(bo)旅(lv)懸(xuan)浮(fu)細胞培(pei)養生(sheng)物反應(ying)器(qi)可達(da) 15,000 L產量(liang)規模(mo)，而(er)采用貼(tie)壁(bi)細胞微(wei)載體培(pei)養生(sheng)物反應(ying)器(qi)可達(da) 6,000 L 左(zuo)右(you)的(de)規模(mo)。

MDCK細胞的(de)生(sheng)物反應(ying)器(qi)微載體培(pei)養方(fang)法主(zhu)要有以下(xia)幾個步驟：

壹、微載體的(de)前(qian)處理：

用pH為(wei)7.4的(de)PBS緩(huan)沖液(ye)將(jiang)Cytodex系列(lie)微載體浸(jin)泡3~24H;反復(fu)清洗(xi)後(hou)用高(gao)壓(ya)進(jin)行(xing)滅(mie)菌，冷(leng)卻。並用(yong)含牛(niu)血(xue)清的(de)培(pei)養基清洗(xi)後(hou)並加入(ru)同體(ti)積的(de)培(pei)養基備用(yong)。2）

二(er)、MDCK種子細胞的(de)解凍復(fu)蘇(su)：

取(qu)出(chu)凍存(cun)中(zhong)MDCK細胞，置(zhi)於(yu)37℃-39℃的(de)恒溫水(shui)浴(yu)振蕩(dang)器(qi)中(zhong)進行(xing)解(jie)凍復(fu)蘇(su)，再(zai)植(zhi)入(ru)細胞培(pei)養瓶中(zhong)進行(xing)細胞培(pei)養。

三、細胞的(de)轉瓶(ping)擴培(pei)

當細胞培(pei)養瓶中(zhong)的(de)細胞生(sheng)長到90%密度(du)時用(yong)細胞消化液(ye)處理細胞，並(bing)接(jie)入(ru)搖瓶進行(xing)分(fen)瓶(ping)培(pei)養，當細胞生(sheng)長到同樣(yang)密(mi)度(du)時，用(yong)培(pei)養基稀釋(shi)接(jie)入(ru)生(sheng)物反應(ying)器(qi)進行(xing)擴培(pei)。

四、生(sheng)物反應(ying)器(qi)微載體培(pei)養：

MDCK細胞接(jie)種可以依(yi)照(zhao) 比例為(wei)2-25g微載體/L（培(pei)養基）、5-50個細胞/載體的(de)比例接(jie)入(ru)生(sheng)物反應(ying)器(qi)中(zhong)進行(xing)擴大培(pei)養。具體詳(xiang)盡(jin)參(can)數(shu)可以根據(ju)相關的(de)《胞培(pei)養操(cao)作說(shuo)明(ming)》進(jin)行(xing)設(she)定(ding)調整(zheng)。

五(wu)、病毒的(de)感染接(jie)種：

當生(sheng)物反應(ying)器(qi)內培(pei)養的(de)MDCK細胞90%在微載體表(biao)面(mian)形成致(zhi)密(mi)層(ceng)後(hou)，應(ying)當停(ting)止攪拌(ban)，當(dang)微載體沈澱於生(sheng)物反應(ying)器(qi)的(de)地步是，更新(xin)培(pei)養基，按(an)照TPCK胰酶(mei)1-20μg/ml、病毒感染復(fu)數(shu)0.01-1接(jie)種病毒培(pei)養2h後(hou)，補充培(pei)養基與(yu)原來的(de)量(liang)相壹致(zhi)；

六、病毒收獲

當(dang)病毒接(jie)種10H後(hou)，需要每(mei)小(xiao)時取(qu)樣(yang)觀(guan)察(cha)細胞的(de)病變(bian)效應(ying)及(ji)CPE值，當CPE值(zhi)大達(da)80%以上時，即(ji)可(ke)進行(xing)病毒收獲、分(fen)析(xi)測(ce)定(ding)等操(cao)作環(huan)節，結合分(fen)析結(jie)果(guo)與(yu)相關《檢驗(yan)規(gui)程(cheng)》執行(xing)下(xia)壹(yi)步操(cao)作。

【MDCK細胞生(sheng)產疫(yi)苗(miao)流程(cheng)】

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