熒(ying)光定量(liang)PCR出(chu)現CT值(zhi)異常(chang)怎麽辦(ban)？

熒(ying)光定量(liang)PCR是(shi)生(sheng)物(wu)醫學(xue)中(zhong)常(chang)用(yong)的(de)檢測(ce)核酸病(bing)毒(du)的方(fang)法(fa)之(zhi)壹，由此(ci)，這幾(ji)年PCR 儀(yi)也成了(le)近(jin)幾年(nian)臨(lin)床檢測(ce)和(he)分子(zi)生(sheng)物(wu)學研(yan)究(jiu)的(de)重(zhong)要實(shi)驗(yan)室(shi)設(she)備。 我(wo)們(men)知道(dao)CT值(zhi)是PCR 擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線中(zhong)的(de)重(zhong)要參數(shu)，那麽CT值(zhi)是(shi)什麽(me)？它與 PCR擴(kuo)增(zeng)存在什麽(me)關系？為(wei)什麽(me)有的時(shi)候(hou)基因擴(kuo)增(zeng)實驗(yan)中(zhong)會(hui)出(chu)現 CT 值(zhi)異常(chang)甚(shen)至(zhi)缺(que)少CT值的(de)情(qing)況？

什麽(me)是CT值？

在(zai)熒(ying)光定量(liang)PCR擴(kuo)增(zeng)實驗(yan)中(zhong)，當(dang)擴增(zeng)產物(wu)的熒(ying)光信號(hao)（Fluorescence signal）達到(dao)設(she)定的熒(ying)光閾值(zhi)（FLUORESCENCE threshold）時(shi)的所對(dui)應(ying)的擴增(zeng)循(xun)環數（Cycle Threshold）。也(ye)可(ke)以理(li)解(jie)為(wei)在qPCR實(shi)驗(yan)過(guo)程(cheng)中(zhong)初始(shi)模(mo)板(ban)擴(kuo)增(zeng)到壹定產物(wu)量(liang)值(zhi)時(shi)，所對(dui)應(ying)的循(xun)環數。 CT 值(zhi)的表(biao)達(da)公(gong)式(shi)為(wei)：擴增(zeng)產物(wu)量(liang)=起(qi)始(shi)模(mo)板(ban)量(liang)×（ 1+En）循(xun)環個數。


通常(chang)QPCR實驗(yan)中(zhong)CT值(zhi)的異常(chang)主要有(you)以(yi)下幾(ji)種情(qing)況：

 壹、擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線正常(chang)，CT值偏(pian)大或偏(pian)小

從(cong)CT值表(biao)達公(gong)式(shi)中(zhong)我(wo)們(men)可(ke)以看(kan)出(chu)初始(shi)模(mo)板(ban)的(de)質(zhi)量(liang)和(he)擴增(zeng)效率，會(hui)直(zhi)接(jie)影響(xiang)到(dao)CT值的(de)大(da)小。 如果(guo)擴(kuo)增(zeng)起(qi)始(shi)模(mo)板(ban)量(liang)濃(nong)度(du)高(gao)或引(yin)物(wu)設(she)計(ji)不合(he)適那麽所用(yong)的(de)循(xun)環數就(jiu)會小，即(ji)出(chu)現Ct值(zhi)過(guo)小；反(fan)之(zhi)，起(qi)始(shi)模(mo)板(ban)量(liang)濃(nong)度(du)過(guo)低(di)，Ct值(zhi)會偏(pian)大。 PCR擴(kuo)增(zeng)效率與(yu) CT 值(zhi)也是(shi)成反(fan)比(bi)關(guan)系(xi)，擴(kuo)增(zeng)效率高(gao)則(ze)CT值(zhi)小，擴(kuo)增(zeng)效率低(di)則(ze)需要要用(yong)到(dao)的循(xun)環數增(zeng)加所對(dui)應(ying)的CT值也會(hui)偏(pian)高(gao)。另外(wai)，合理(li)的引(yin)物(wu)設(she)計(ji)，防汙(wu)染試劑的應(ying)用(yong)也(ye)會影響(xiang)到(dao)CT值的(de)大(da)小。

二(er)、 有擴(kuo)增(zeng)曲(qu)線，但卻(que)沒(mei)有(you)CT值，CT值(zhi)顯(xian)示(shi)狀態為(wei)Undetermined

這種情(qing)況下妳(ni)通常(chang)也會(hui)發現(xian)由於閥值(zhi)位置(zhi)不正(zheng)常(chang)正常(chang)導致(zhi)熒(ying)光閾值(zhi)線與擴增(zeng)曲(qu)線沒有交(jiao)點(dian)，所以(yi)儀(yi)器顯(xian)示(shi)狀態為(wei)Undetermined。出(chu)現這(zhe)種如果(guo)擴(kuo)增(zeng)模板濃(nong)度(du)是(shi)正(zheng)常(chang)的，那麽多數原(yuan)因可(ke)能(neng)是由於系統界(jie)面參數(shu)設(she)置錯誤(wu)所導致(zhi)的(de)。如果(guo)參與(yu)擴(kuo)增(zeng)的模板(ban)並(bing)非(fei)所有(you)的(de)孔，而系(xi)統界(jie)面在所有(you)的(de) （ C-H行）都默(mo)認(ren) 設(she)上(shang)了(le)target和(he) sample 參與(yu)CT值(zhi)計(ji)算。這(zhe)個時候(hou)系統會(hui)默(mo)認(ren)所有(you)孔(kong)參與(yu)熒(ying)光定量(liang) PCR 實(shi)驗(yan) 。導致(zhi)CT值(zhi)錯誤(wu)。如果(guo)我(wo)們(men)把無樣品(pin)C-H 行(xing) 數的(de)target和(he)sample 前面的“√" 清除(chu) 後(hou)重(zhong)新(xin)分析(xi)計(ji)算，就(jiu)會(hui)得(de)到正常(chang)的熒(ying)光閾值(zhi)線 C T 值了(le)。

三、 有(you)擴增(zeng)曲(qu)線，閾值線的位置(zhi)也(ye)正常(chang)，但大(da)多數孔(kong)仍(reng)然(ran)不顯(xian)示(shi)CT值。

當系統界(jie)面C-H行 顯(xian)示(shi)出(chu)現異常(chang)提示(shi)（比如黃(huang)色(se)三(san)角(jiao)形(xing)標(biao)示(shi)），在數據分析(xi)中(zhong)會(hui)再(zai)很多孔內出(chu)現 BLFAIL提(ti)醒。這表(biao)明基線分析(xi)失(shi)敗(bai)，如果(guo)確(que)定我(wo)們(men)在(zai)反(fan)應(ying)物(wu)中(zhong)加(jia)了(le)熒(ying)光染料(liao)，如果(guo)加(jia)了(le)，那麽這(zhe)種 熒(ying)光值偏(pian)低現(xian)象(xiang)，可(ke)能(neng)由於使用(yong)了(le)透光性不好(hao)PCR 耗材(cai)或不配(pei)套(tao)的耗材(cai)所導致(zhi)。這(zhe)種情(qing)況較(jiao)容(rong)易出(chu)現在(zai)底部(bu)或側(ce)邊(bian)掃描(miao)檢測(ce)的PCR 儀(yi)器中(zhong)；朗(lang)基的 Q2000系(xi)列采用(yong)的(de)頂(ding)部(bu)CCD 實時(shi)檢測(ce)技術甚(shen)至(zhi)可(ke)以用(yong)*不透(tou)明的白管進行實(shi)驗(yan)，所以(yi)壹般(ban)不會(hui)存(cun)在這(zhe)種問(wen)題。

四(si)、 還有壹種情(qing)況較(jiao)為(wei)常(chang)見也(ye)就是(shi)擴增(zeng)曲(qu)線不正(zheng)常(chang)，CT值都(dou)顯(xian)示(shi)“Undetermined"。 

此(ci)時，如果(guo)在(zai)熒(ying)光定量(liang)PCR檢測(ce)報告頁(ye)面出(chu)現了(le)ROX的熒(ying)光值 為(wei)0的情(qing)況，很可(ke)能(neng)是使用(yong)了(le)不含(han)ROX 試(shi)劑而系(xi)統參數(shu)中(zhong)未(wei)做(zuo)修(xiu)改(gai)所造(zao)成(cheng)，及(ji)時(shi)在分析(xi)設(she)置中(zhong)將 Passive reference dye的(de)ROX 改(gai)成None，再(zai)重(zhong)新(xin)分析(xi)即(ji)可(ke)正常(chang)顯(xian)示(shi)。有些沒有(you)ROX 校正(zheng)的PCR 儀(yi)中(zhong)也(ye)較(jiao)容(rong)易出(chu)現此(ci)類問(wen)題。 
從(cong)上(shang)面Qpcr實驗(yan)中(zhong)常(chang)幾種常(chang)遇(yu)到(dao)的幾(ji)種情(qing)況中(zhong)可(ke)以看(kan)出(chu)：要想(xiang)獲(huo)得(de) 準確的(de)pcr實(shi)驗(yan)結果(guo)，實(shi)驗(yan)的(de)設(she)計(ji)及(ji)樣本(ben)、配套試(shi)劑(ji)耗材(cai)、儀(yi)器類型(xing)的(de)選(xuan)擇、正確的(de)軟(ruan)件(jian)操作(zuo)等(deng)都(dou)與實(shi)驗(yan)本(ben)身密(mi)不可(ke)分。

    蘇(su)州(zhou)阿(e)爾法生(sheng)物(wu)實驗(yan)器(qi)材(cai)有(you)限(xian)公(gong)司(si)13年專(zhuan)註生(sheng)物(wu)實驗(yan)室(shi)儀(yi)器設(she)備和(he)試劑(ji)耗材(cai) 的(de)綜(zong)合供(gong)應(ying)包(bao)括熒(ying)光定量(liang)PCR 儀(yi)、振蕩(dang)培(pei)養(yang)箱(xiang)、生物(wu)發酵罐(guan)、移(yi)液(ye)器等 ，廣(guang)泛應(ying)用(yong)於(yu)生命(ming)科學(xue)、生(sheng)物(wu)制藥、防疫(yi)檢測(ce) 、 科研等(deng)領(ling)域(yu)；以(yi)服(fu)務(wu)取(qu)勝，以高(gao)性(xing)價比吸(xi)睛(jing)，阿(e)爾法從(cong)售前到(dao)售後(hou)，打造(zao)實(shi)驗(yan)室(shi)儀(yi)器設(she)備全(quan)服(fu)務(wu)鏈(lian)體(ti)系(xi)，滿(man)足客戶應(ying)用(yong)需求。