臺(tai)盼(pan)藍(lan)染色細胞(bao)計(ji)數(shu)的(de)實(shi)驗步(bu)驟和方法(fa)

細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)是(shi)確定培養中鋪板(ban)的(de)細胞(bao)濃度、確定細胞(bao)活(huo)力(li)和評(ping)估細胞(bao)分(fen)離(li)程序(xu)結(jie)果(guo)的(de)壹(yi)個組成部分(fen)。建(jian)議在細(xi)胞(bao)分(fen)離(li)之前進行(xing)初(chu)始細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)；然後(hou)可(ke)以將該(gai)數(shu)字與(yu)細胞(bao)分(fen)離(li)後(hou)的(de)細胞(bao)計(ji)數(shu)進行(xing)比(bi)較(jiao)，以(yi)計(ji)算(suan)細胞(bao)恢復率。此外(wai)，當預期細胞(bao)活(huo)力(li)可(ke)能(neng)會降低時(shi)，應進行(xing)活(huo)細胞(bao)計(ji)數(shu)，例如，在處(chu)理(li)冷(leng)凍保(bao)存的(de)細胞(bao)或離體操作(zuo)的(de)細胞(bao)時(shi)。

    可(ke)以使用(yong)臺(tai)盼(pan)藍(lan)或3% 乙酸(suan)和亞甲(jia)藍(lan)進行(xing)細胞(bao)計(ji)數(shu). 進行(xing)總有核細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)時(shi)，建議(yi)使用(yong) 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)。乙酸(suan)溶(rong)解(jie)細胞(bao)膜，亞甲(jia)藍(lan)染色暴露(lu)的(de)細胞(bao)核。由(you)於成(cheng)熟的(de)紅(hong)細胞(bao)缺乏細(xi)胞(bao)核，因此(ci)在計(ji)數(shu)時(shi)被排(pai)除在外(wai)。或者，建議使用(yong)臺(tai)盼(pan)藍(lan)來計(ji)數(shu)活(huo)的(de)哺乳(ru)動物細胞(bao)。臺(tai)盼(pan)藍(lan)穿透細胞(bao)膜，因此(ci)它進入細胞(bao)膜受(shou)損(sun)的(de)細胞(bao)（死(si)細(xi)胞(bao)）的(de)細胞(bao)質(zhi)，將它們染(ran)成(cheng)藍(lan)色。活(huo)細胞(bao)保持(chi)完整，可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)排(pai)除藍(lan)色染料的(de)能力(li)與(yu)死(si)細(xi)胞(bao)區分(fen)開(kai)來。在這(zhe)種情況下，人(ren)們將計(ji)算(suan)完整的(de)活(huo)細胞(bao)。

   本(ben)文描(miao)述了(le)如(ru)何(he)使用(yong) 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)進行(xing)總有核細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)，以及(ji)如何(he)通(tong)過(guo)臺(tai)盼(pan)藍(lan)染料(liao)排(pai)除進行(xing)活(huo)細胞(bao)計(ji)數(shu)。

材料準(zhun)備(bei)：

3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)（或臺(tai)盼(pan)藍(lan)

96 孔(kong)板(ban)（例(li)如(ru) Corning® 96 孔(kong)圓底(di)微(wei)孔(kong)板(ban)，貨(huo)號 #38018）或微量離心管（例如(ru) Costar® 微(wei)量離心管，貨(huo)號#38090）

血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)（血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)板(ban)）和蓋玻(bo)片(pian)

70% C2H6O

移液(ye)器(qi)（例(li)如(ru)瑞寧移液(ye)器(qi)）

實(shi)驗步(bu)驟和方法(fa)：

第(di)壹部分(fen)：樣(yang)品(pin)制備(bei)

選(xuan)項 1：用(yong) 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)對(dui)總有核細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)進行(xing)細胞(bao)稀(xi)釋

  使用(yong)磷(lin)酸(suan)鹽(yan)緩(huan)沖(chong)鹽水(shui)或無血(xue)清(qing)培(pei)養基對(dui)充(chong)分(fen)混(hun)合的(de)單(dan)細胞(bao)懸浮(fu)液進行(xing)適(shi)當稀(xi)釋。為(wei)了(le)準(zhun)確表示濃(nong)度，請使用(yong)至少(shao) 20 μL 的(de)細胞(bao)懸浮(fu)液進行(xing)稀(xi)釋。

示例(li)：制(zhi)備(bei) 10 倍稀(xi)釋液(ye)

在微(wei)量離心管或 96 孔(kong)板(ban)的(de)孔(kong)中加(jia)入(ru) 180 μL 的(de) 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)。混合細(xi)胞(bao)懸浮(fu)液，將 20 μL 添(tian)加(jia)到含有 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)的(de)試管或孔(kong)中。

選(xuan)項 2：通(tong)過(guo)臺(tai)盼(pan)藍(lan)染料(liao)排(pai)除對(dui)活(huo)細胞(bao)計(ji)數(shu)進行(xing)細胞(bao)稀(xi)釋

 確保要計(ji)數(shu)的(de)細胞(bao)懸浮(fu)液*重新懸(xuan)浮(fu)。在細(xi)胞(bao)沈(chen)降之前(qian)，將適(shi)量的(de)細胞(bao)懸液(ye) (20-200 μL) 放(fang)入離(li)心管中。加(jia)入(ru)等(deng)體積(ji)的(de) 0.4% 臺(tai)盼(pan)藍(lan)並(bing)輕輕混(hun)合。將混(hun)合物(wu)在室(shi)溫 (15°C – 25°C) 下(xia)孵育 5 分(fen)鐘(zhong)。

第(di)二部分(fen)：使用(yong)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)進行(xing)細胞(bao)計(ji)數(shu)

   通(tong)過(guo)用(yong) 70% C2H6O清(qing)潔腔室表(biao)面來制備(bei)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)。擦(ca)幹(gan)。將蓋(gai)玻(bo)片放(fang)在腔室上(shang)。

 使用(yong) 20 μL 移液(ye)器(qi)重(zhong)新(xin)懸(xuan)浮(fu)細胞(bao)混合物(wu)，並(bing)將 10 μL 的(de)染色細胞(bao)放(fang)入血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)室(shi)。

註(zhu)意(yi)：小(xiao)心不要移動蓋玻片(pian)。允許毛細作(zuo)用(yong)將樣(yang)品(pin)吸(xi)入(ru)。

 將血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)放(fang)在雙(shuang)目光學顯(xian)微鏡的(de)載(zai)物臺(tai)上(shang)。將顯(xian)微鏡調整到(dao) 10 倍放(fang)大倍率並(bing)聚焦在細(xi)胞(bao)上(shang)。

 使用(yong)手動計(ji)數(shu)計(ji)數(shu)器(qi)，計(ji)算(suan)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)四(si)個(ge)外(wai)部正方形中的(de)每壹(yi)個(ge)中(zhong)的(de)細胞(bao)（染色的(de)細胞(bao)核）（圖(tu) 1A），包(bao)括(kuo)位於底部和左(zuo)側周(zhou)邊的(de)細胞(bao)，但不包(bao)括(kuo)位於頂(ding)部和右手(shou)邊(bian)（圖 1B）。如(ru)果(guo)在第(di)壹部分(fen)中(zhong)使用(yong)了(le) 3% 乙酸(suan)和亞-CH3藍(lan)，則(ze)計(ji)算(suan)染色的(de)細胞(bao)核。如(ru)果(guo)在第(di)壹部分(fen)中(zhong)使用(yong)了(le)臺(tai)盼(pan)藍(lan)，則(ze)計(ji)算(suan)未(wei)染(ran)色的(de)活(huo)細胞(bao)。

圖(tu) 1.血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)網(wang)格(ge)線

血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)圖(tu)指(zhi)示（A）四(si)組紅(hong)色和（B）其(qi)中壹(yi)組應用(yong)於計(ji)數(shu)的(de) 16 個(ge)方塊(kuai)。

註(zhu)意(yi)： 適(shi)當的(de)稀(xi)釋系(xi)數(shu)將取(qu)決(jue)於(yu)起始(shi)樣(yang)本中(zhong)存在的(de)大致(zhi)細(xi)胞(bao)數(shu)量，但應(ying)使血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)中(zhong)的(de)細胞(bao)濃度為每(mei)平方(fang)（即(ji)大(da)或主要(yao)正方形）50-100 個(ge)細胞(bao)。如果(guo)血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)上(shang)每(mei)個(ge)主(zhu)要(yao)正方形的(de)細胞(bao)多(duo)於或少(shao)於大約 100 個(ge)，請使用(yong)更大(da)或更小(xiao)的(de)稀(xi)釋因子制(zhi)備(bei)新(xin)的(de)稀(xi)釋樣(yang)品(pin)。

     血(xue)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)器(qi)的(de)九(jiu)個(ge)主要方(fang)塊(kuai)中(zhong)的(de)每壹(yi)個(ge)都代表 0.1 mm 3的(de)總體積(ji)。由於(yu) 1 cm 3相當(dang)於(yu) 1 mL，因此(ci)可(ke)以(yi)使用(yong)以下(xia)等(deng)式(shi)確定細胞(bao)濃度：

有核細(xi)胞(bao)總數(shu)/mL = 每(mei)平方(fang)平均細(xi)胞(bao)數(shu) x 稀(xi)釋因子 x 10 4

示例(li)：如(ru)果(guo)四(si)個(ge)外(wai)部方(fang)塊(kuai)中的(de)每壹(yi)個(ge)的(de)細胞(bao)計(ji)數(shu)在 100 稀(xi)釋因子下(xia)分(fen)別(bie)為(wei) 21、15、20 和 17，則(ze)平均(jun)細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)將為(wei) (21 + 15 + 20 + 17) ÷ 4 = 18.25。

因此(ci)，原(yuan)始(shi)懸(xuan)浮(fu)液中細胞(bao)的(de)總濃(nong)度為：18.25 x 100 x 10^4 = 18,250,000 個(ge)細胞(bao)/mL。

使用(yong)人工(gong)的(de)細胞(bao)計(ji)數(shu)方法誤(wu)差率較高(gao)，為提(ti)高細(xi)胞(bao)計(ji)數(shu)的(de)準(zhun)確度和細胞(bao)計(ji)數(shu)效率可以(yi)使用(yong)全自動細胞(bao)計(ji)數(shu)儀進行(xing)細胞(bao)計(ji)數(shu)。博大博聚旗下(xia)的(de)全自動細胞(bao)細胞(bao)計(ji)數(shu)儀系(xi)列(lie)，具有多(duo)種規格供選擇，可以(yi)滿(man)足(zu)不同的(de)用(yong)戶需求(qiu)。

  蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法(fa)生物實(shi)驗器(qi)材有限公(gong)司(si)十三年(nian)專註(zhu)於(yu)生物(wu)反應器(qi)，生(sheng)物(wu)反應器(qi)、發(fa)酵罐(guan)、PCR儀(yi)、凝膠(jiao)成像(xiang)、移液(ye)器(qi)、全自動細胞(bao)計(ji)數(shu)儀、顯(xian)微鏡、熒光顯(xian)微鏡、電(dian)泳(yong)儀(yi)、電(dian)泳(yong)槽等(deng)實(shi)驗室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)，生(sheng)物反應器(qi)采(cai)用(yong)進口零(ling)部件(jian)，三(san)重(zhong)防(fang)汙染密封設(she)計(ji)工(gong)藝(yi)，有2L/5L/15L/75L/150L/200L等(deng)多(duo)種規格可以供(gong)選擇，可用(yong)於生(sheng)產 重組蛋白(bai)等(deng)創(chuang)新(xin)藥開(kai)發(fa)、生產。另(ling)外支(zhi)持(chi)特殊(shu)定制已適(shi)應不同類型(xing)的(de)客戶(hu)，具有價廉質(zhi)優、售(shou)後(hou)有保障(zhang)基本實(shi)現了(le)進口生物反應的(de)國(guo)產化替(ti)代。