關(guan)於(yu)SDS-PAGE凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳的(de)常見問(wen)答

SDS-PAGE的工(gong)作(zuo)原(yuan)理(li)是(shi)什麽？

聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺凝(ning)膠(jiao)是(shi)由(you)丙烯(xi)酰胺和交聯(lian)劑(ji)N,N'-亞(ya)-CH3雙(shuang)丙烯酰胺在催化(hua)劑過(guo)硫(liu)酸(suan)銨(AP)和N,N,N',N'-四(si)-CH3乙二胺(TEMED)的作(zuo)用(yong)下組成(cheng)。它是(shi)壹(yi)種(zhong)具(ju)有(you)三(san)維(wei)網絡結構的凝(ning)膠(jiao)。PAGE可(ke)以根據(ju)蛋(dan)白質(zhi)分子的(de)電(dian)荷(he)和分子量(liang)不(bu)同(tong)而引(yin)起(qi)的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)不(bu)同(tong)，將(jiang)蛋白質(zhi)分成(cheng)若幹條(tiao)帶(dai)。SDS是(shi)壹(yi)種(zhong)陰(yin)離子(zi)表(biao)面(mian)活性(xing)劑(ji)，它(ta)可(ke)以在還原劑DTT存在下破(po)壞蛋白質(zhi)的氫(qing)鍵(jian)和疏(shu)水(shui)鍵，並(bing)與蛋白質(zhi)分子按(an)壹(yi)定(ding)比例(li)結合形成(cheng)短棒(bang)狀(zhuang)復合(he)物。相(xiang)同(tong)的(de)密(mi)度(du)，與(yu)蛋白質(zhi)的分子量(liang)呈(cheng)正相關(guan)，不(bu)同(tong)分子量(liang)的(de)蛋白質(zhi)所形成(cheng)的復(fu)合物的(de)長度(du)是(shi)不(bu)同(tong)的(de)。SDS使帶(dai)負(fu)電(dian)荷(he)的蛋(dan)白質(zhi)的數量(liang)遠(yuan)遠(yuan)超過(guo)其(qi)原(yuan)始(shi)電(dian)荷(he)，掩蓋(gai)了(le)各種(zhong)蛋(dan)白質(zhi)分子之(zhi)間(jian)的天然(ran)電荷(he)差(cha)異(yi)。因此(ci)，各種(zhong)蛋(dan)白質(zhi)-SDS復合(he)物在電(dian)泳過(guo)程(cheng)中的(de)遷移(yi)率(lv)不(bu)再(zai)受(shou)原(yuan)有(you)電(dian)荷(he)和分子形狀(zhuang)的影(ying)響(xiang)，而只(zhi)取(qu)決於(yu)相對分子質(zhi)量(liang)。

聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺凝(ning)膠(jiao)

聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺凝(ning)膠(jiao)通(tong)常由(you)上(shang)層的(de)濃縮(suo)膠(jiao)和下層的分離膠(jiao)組(zu)成(cheng)。上(shang)下凝(ning)膠(jiao)的(de)區別在於(yu)丙烯(xi)酰胺的濃度(du)和 Tris-HCl 的(de) pH 值(zhi)。在電(dian)泳過(guo)程(cheng)中，向(xiang)凝(ning)膠(jiao)施(shi)加電場(chang)，帶(dai)負(fu)電(dian)的(de)蛋(dan)白質(zhi)從負(fu)極遷移(yi)到正極。最(zui)常見的(de)電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液由(you) Tris 和甘(gan)氨(an)酸(suan)組(zu)成(cheng)。濃縮(suo)膠(jiao)中的(de) pH 值為(wei) 6.8，只有(you)少數甘(gan)氨(an)酸(suan)分子解離。因此(ci)，經 SDS 處理(li)的蛋(dan)白質(zhi)分子在上(shang)層甘(gan)氨(an)酸(suan)分子和下層 Cl- 離子之(zhi)間(jian)移(yi)動。這(zhe)個過(guo)程(cheng)將(jiang)凝(ning)膠(jiao)中的(de)蛋白質(zhi)樣(yang)品(pin)壓縮(suo)成(cheng)比最(zui)初加載的(de)體(ti)積小得(de)多的(de)條(tiao)帶(dai)。隨(sui)著(zhe)電泳的進行，蛋(dan)白質(zhi)移(yi)動到分離凝(ning)膠(jiao)（pH 8.8），甘(gan)氨(an)酸(suan)分子在此(ci)解離，隨著(zhe)運動速度(du)增(zeng)加而超過(guo)蛋(dan)白質(zhi)。所以，在分離凝(ning)膠(jiao)中，每(mei)種蛋白質(zhi)的移(yi)動速度(du)取(qu)決於(yu)其分子量(liang)。分子量(liang)小(xiao)的蛋白質(zhi)可(ke)以較(jiao)容易(yi)地通過(guo)凝(ning)膠(jiao)中的(de)孔，而分子量(liang)大的蛋(dan)白質(zhi)則更(geng)難(nan)通過(guo)。壹(yi)段時間(jian)後(hou)，蛋(dan)白質(zhi)根據(ju)大小到達不(bu)同(tong)的(de)距離(li)，達(da)到蛋白質(zhi)分離的(de)目(mu)的。

圖(tu) 1. 聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳示意圖(tu)

如何通過(guo) SDS-PAGE 確定蛋白質(zhi)的分子量(liang)？

SDS-PAGE是(shi)測(ce)定未知蛋白質(zhi)分子量(liang)的(de)主要方(fang)法(fa)。同(tong)時(shi)對分子量(liang)已知的蛋(dan)白質(zhi)和未知樣(yang)品(pin)進行電(dian)泳(yong)。染色後(hou)，根(gen)據(ju)標(biao)準(zhun)蛋白的相(xiang)對遷移(yi)率(lv)和分子量(liang)的(de)對數，得(de)到壹(yi)條(tiao)線(xian)，利用(yong)其(qi)相(xiang)對遷移(yi)率(lv)確定未知樣(yang)品(pin)的(de)分子量(liang)。在實(shi)驗室中，用(yong)壹(yi)種(zhong)與(yu)染料共價偶聯(lian)的(de)標(biao)準(zhun)分子量(liang)蛋(dan)白質(zhi)作(zuo)為(wei)參(can)考蛋白質(zhi)，粗略地指示未知蛋白質(zhi)的大小。這(zhe)種預染色的蛋(dan)白質(zhi)標記(ji)可(ke)以在電(dian)泳期(qi)間或(huo)轉(zhuan)移(yi)膜時(shi)直(zhi)接(jie)觀(guan)察到。

電泳(yong)後(hou)，肉(rou)眼(yan)無(wu)法直接觀察到蛋白質(zhi)分離，需(xu)要(yao)後(hou)續(xu)的(de)染(ran)色技術。考馬斯(si)亮(liang)藍(lan)染(ran)色和銀染是(shi)常規(gui)檢(jian)測(ce)和定(ding)量(liang)電(dian)泳分離蛋(dan)白質(zhi)的常用(yong)方(fang)法(fa)。經(jing)過(guo)固(gu)定(ding)-染(ran)色-脫色等簡單處理(li)後(hou)，可(ke)以清楚(chu)地觀察到蛋白質(zhi)的分布。隨(sui)著(zhe)高靈敏度(du)蛋(dan)白質(zhi)分析(xi)方(fang)法(fa)和蛋(dan)白質(zhi)鑒(jian)定(ding)技術的改進，熒光(guang)標(biao)記(ji)、同位素(su)標(biao)記(ji)技術等新型(xing)染色方(fang)法(fa)的(de)靈(ling)敏度(du)大大提(ti)高，同(tong)時(shi)也(ye)兼容自動化(hua)蛋白質(zhi)組平臺(tai)凝(ning)膠(jiao)切割技術。開(kai)發了(le)較(jiao)高靈敏度(du)和自動化(hua)的染色技術。

通(tong)常在每(mei)次實(shi)驗之前準(zhun)備新(xin)鮮的 SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)。然(ran)而，凝(ning)膠(jiao)也(ye)可(ke)以在 4°C 的(de)清水(shui)中儲(chu)存約壹(yi)周。如果凝(ning)膠(jiao)染(ran)色後(hou)不(bu)能(neng)及(ji)時拍(pai)照，則需(xu)要(yao)將其(qi)放(fang)入水(shui)中，以防止(zhi)凝(ning)膠(jiao)幹燥(zao)和收(shou)縮(suo)。建(jian)議(yi)盡快(kuai)拍(pai)攝染色結果(guo)。如果凝(ning)膠(jiao)長時間(jian)浸泡(pao)在水(shui)中，條(tiao)帶(dai)會散開(kai)。

探究(jiu)電(dian)泳實(shi)驗過(guo)程(cheng)妳會發現(xian)，其(qi)實凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳步驟中，配(pei)制(zhi) SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)是(shi)壹(yi)個(ge)重(zhong)要(yao)的(de)環(huan)節(jie)，同時也(ye)是(shi)花(hua)費(fei)時(shi)間(jian)較(jiao)多的壹(yi)步。那麽有(you)沒(mei)有(you)什麽辦(ban)法(fa)可(ke)以加速這(zhe)壹(yi)過(guo)程(cheng)呢(ne)？其(qi)實(shi)，市(shi)場(chang)已經在推(tui)出(chu)預制(zhi)膠(jiao)，這(zhe)種SDS-PAGE 凝(ning)膠(jiao)是(shi)已經配(pei)制(zhi)好的(de)，無(wu)需(xu)經(jing)過(guo)繁瑣(suo)的(de)制(zhi)膠(jiao)流(liu)程，拆(chai)了(le)包(bao)裝(zhuang)就可(ke)以直接(jie)使用的。上(shang)海天(tian)能 Precast Gel預制(zhi)膠(jiao)不(bu)僅僅使電泳實驗的時(shi)間縮(suo)短(duan)了(le)30%，而且(qie)這(zhe)種預制(zhi)膠(jiao)還采(cai)用(yong)了(le)新型(xing)緩(huan)沖(chong)液配(pei)制(zhi)技術，使電泳條帶(dai)清(qing)晰(xi)而均(jun)勻，有(you)效避(bi)免(mian)了(le)SDS水解或(huo)PH值(zhi)不(bu)穩(wen)定(ding)所造(zao)成(cheng)的凝(ning)膠(jiao)性(xing)能(neng)不(bu)穩(wen)定(ding)，條(tiao)帶(dai)不(bu)均(jun)勻等缺陷(xian)。

蘇州阿爾法(fa)生物所提(ti)供的(de)天(tian)能(neng)系列(lie)SDS蛋(dan)白質(zhi)預制(zhi)膠(jiao)、梯(ti)度(du)預制(zhi)膠(jiao)、電(dian)泳儀(yi)、電泳(yong)槽(cao)、核酸(suan)電(dian)泳(yong)預制(zhi)膠(jiao)、核(he)酸電(dian)泳儀(yi)、電泳(yong)儀(yi)電源(yuan)、電泳槽(cao)等實驗室設備。