Western Blot實驗(yan)步(bu)驟

本(ben)文(wen)摘要(yao)
      蛋(dan)白(bai)質印(yin)跡(ji)技術（免疫印(yin)跡(ji)實驗(yan)）又(you)稱(cheng)為(wei)Western Blot。它是分子生(sheng)物(wu)學(xue)、生(sheng)物(wu)化(hua)學(xue)和免(mian)疫遺傳(chuan)學(xue)中(zhong)常(chang)用的壹種實驗(yan)方(fang)法。Western Blot主要(yao)用於檢(jian)測(ce)或分析(xi)蛋(dan)白(bai)，應(ying)用領(ling)域(yu)集中(zhong)在(zai)基因表達(da)研究(jiu)、抗體活(huo)性檢(jian)測(ce)和疾病診斷等。
01  蛋白(bai)質印(yin)跡(ji)基本(ben)流(liu)程(cheng)圖(tu)
 
 
02 western blot步(bu)驟
樣品準備(bei)：

• Tanon 連續(xu)梯(ti)度(du)預制膠(jiao)（4-20% 10 孔(kong)/15 孔/17 孔(kong)）；  （4-12% 10 孔/15 孔/17 孔）

• Tanon Mops/MES 電(dian)泳緩沖液（粉(fen)劑(ji)）

• Tanon 預染(ran)蛋(dan)白(bai) Marker

• Tanon 4×LDS Loading Buffer

• Tanon 快速(su)蛋(dan)白染(ran)液

• 預制膠(jiao)規(gui)格(ge)的選擇(ze)

 
    在(zai)不(bu)使用預制膠(jiao)的情況(kuang)下(xia)，需(xu)要(yao)自(zi)行配(pei)置(zhi)適合(he)蛋白(bai)電(dian)泳SDS膠(jiao)，采(cai)取(qu)自(zi)制膠(jiao)的方法從加入緩沖液到(dao)制膠(jiao)完(wan)成(cheng)這壹(yi)過程大概需(xu)要(yao)花(hua)費(fei)將近(jin)1個(ge)小(xiao)時(shi)。並(bing)且(qie)由於配比(bi)過程中的認(ren)為(wei)誤差(cha)容(rong)易產生(sheng)濃(nong)度(du)不均壹，穩(wen)定性(xing)差，已出(chu)現外(wai)八型、笑(xiao)臉(lian)型等條帶。采用天能(neng)系(xi)列(lie)預制膠(jiao)具(ju)有(you)較高(gao)的穩定性和均壹性(xing)，使蛋(dan)白電(dian)泳條(tiao)帶更清(qing)晰銳(rui)利，使得條帶更加均勻(yun)。還(hai)有(you)重(zhong)要(yao)的壹點(dian)就(jiu)是可以(yi)免(mian)去制膠(jiao)的時間，大大提升了實驗(yan)效(xiao)率。
    蛋白轉印(yin)使用天能(neng)VE-586轉(zhuan)移(yi)電(dian)泳槽(cao)主(zhu)要(yao)優(you)勢(shi)在(zai)於(yu):它可以(yi)在(zai)不(bu)埋冰(bing)的情況(kuang)完(wan)成(cheng)的蛋白電(dian)泳，如(ru)果配合(he)快速(su)轉(zhuan)膜液，整(zheng)個電(dian)泳過程只需(xu)不到(dao)30分(fen)鐘，可同時(shi)轉(zhuan)印(yin)4塊膠，操(cao)作(zuo)方(fang)法也比(bi)較簡便(bian)。在(zai)縮(suo)短轉印(yin)時間的同時(shi)，實現(xian)了(le)蛋白(bai)樣品的高(gao)效轉印(yin)。
 
蛋白電(dian)泳
目前(qian)常用的是SDS-PAGE（十二烷基硫(liu)酸鈉(na)-聚丙(bing)烯酰(xian)胺(an)凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳），蛋(dan)白(bai)質會根(gen)據(ju)分子量大小(xiao)分(fen)開(kai)，分子量的蛋白會留(liu)在(zai)膠(jiao)的下部，分子量大的會在(zai)膠(jiao)的頂部(bu)。
 
 
04轉膜
    轉(zhuan)膜(mo)主要(yao)是將蛋白質從凝(ning)膠(jiao)轉移到(dao)膜(mo)上(shang)，常用的是NC膜和PVDF（聚偏(pian)氟乙(yi)烯），由(you)於膜與(yu)蛋白(bai)質高(gao)度(du)親和的能(neng)力，所(suo)以(yi)更(geng)容(rong)易與(yu)蛋白(bai)結合(he)。為(wei)了便(bian)於(yu)觀察電(dian)泳效(xiao)果和轉(zhuan)膜(mo)效(xiao)果，可以(yi)使(shi)用蛋白(bai)預染(ran)Marker，以(yi)方(fang)便判斷蛋白(bai)分(fen)子量大小(xiao)。
     蛋(dan)白預染(ran)的傳(chuan)統(tong)方(fang)法是膜將置於(yu)脫(tuo)色(se)搖床上(shang)，用1×麗(li)春紅染(ran)液振蕩預染(ran)5min。然(ran)後(hou)用水(shui)沖洗(xi)掉(diao)沒染(ran)上(shang)的染(ran)液就(jiu)可看到(dao)膜(mo)上(shang)的蛋白。
     蛋白(bai)轉(zhuan)印(yin)使用天能(neng)VE-586轉(zhuan)移(yi)電(dian)泳槽(cao)主(zhu)要(yao)優(you)勢(shi)在(zai)於(yu):它可以(yi)在(zai)不(bu)埋冰(bing)的情況(kuang)完(wan)成(cheng)的蛋白電(dian)泳，如(ru)果配合(he)快速(su)轉(zhuan)膜液，整(zheng)個電(dian)泳過程只需(xu)不到(dao)30分(fen)鐘，可同時(shi)轉(zhuan)印(yin)4塊膠，操(cao)作(zuo)方(fang)法也比(bi)較簡便(bian)。在(zai)縮(suo)短轉印(yin)時間的同時(shi)，實現(xian)了(le)蛋白(bai)樣品的高(gao)效轉印(yin)。
 
 
05封(feng)閉(bi)
     轉(zhuan)印(yin)完成(cheng)後，為(wei)阻止抗體的非特異性結合(he)，需(xu)要(yao)用脫(tuo)脂牛奶或者牛(niu)血(xue)清(qing)蛋白(bai)（BSA）作(zuo)為(wei)緩沖液來(lai)填(tian)充封(feng)閉(bi)空(kong)白結合(he)位點(dian)。
     加入二抗稀(xi)釋液（壹(yi)般1:1000甚(shen)至(zhi)1:10000用TBST稀(xi)釋），放(fang)在(zai)搖床上(shang)，室溫(wen)下孵(fu)育1h後，用TBST在(zai)室(shi)溫下(xia)脫(tuo)色(se)搖床上(shang)洗(xi)兩次(ci)，每次10min；再用TBS洗(xi)壹次(ci)，10min，即可進(jin)行化(hua)學(xue)發光(guang)反(fan)應。
      註(zhu)意(yi)：二抗孵育(yu)之後(hou)也(ye)要(yao)註(zhu)意(yi)充分洗(xi)滌，壹(yi)般30min左(zuo)右(you)為(wei)宜，如(ru)果洗(xi)膜不(bu)夠(gou)充分(fen)，顯(xian)影(ying)時會造成(cheng)雜色(se)背景(jing)。
 
 
06 ECL化(hua)學發光(guang)反(fan)應：
     在(zai)工(gong)作(zuo)臺(tai)上(shang)鋪壹(yi)張保(bao)鮮膜，將(jiang)PVDF膜(mo)置於保(bao)鮮膜上(shang)。將ECL的A和B兩(liang)種(zhong)試(shi)劑(ji)在(zai)EP管(guan)內等體積(ji)混(hun)合(he)（註(zhu)意(yi)吸(xi)完(wan)A試(shi)劑(ji)後吸(xi)B試(shi)劑(ji)前要(yao)更(geng)換(huan)槍頭(tou)），然(ran)後(hou)均勻(yun)滴在(zai)PVDF膜(mo)的蛋白面(mian)，反(fan)應1~2min後(hou)，將PVDF膜上(shang)多(duo)余的ECL發光(guang)液吸(xi)幹(gan)，進(jin)行固(gu)定(ding)。
 
 
07凝膠圖(tu)象分(fen)析(xi)
將(jiang)膠(jiao)片進行掃描或拍照(zhao)，使用凝膠(jiao)成(cheng)像(xiang)儀進行成(cheng)像(xiang)分(fen)析(xi)。常(chang)用的凝膠成(cheng)像(xiang)儀有(you)天(tian)能(neng)系(xi)列(lie)的T4600，T5200等系(xi)列(lie)。 

蘇州阿爾法生(sheng)物(wu)13年(nian)專(zhuan)註(zhu)於(yu)生(sheng)物(wu)實驗(yan)室(shi)儀器(qi)與(yu)試劑(ji)耗材(cai)供應(ying)，天(tian)能(neng)系(xi)列(lie)產(chan)品主要(yao)包(bao)括(kuo)Tanon凝(ning)膠成(cheng)像(xiang)儀，ECL發光(guang)液，快(kuai)速(su)轉(zhuan)印(yin)緩沖液，上(shang)樣緩沖液，蛋(dan)白MARK等。