熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR實驗中CT值出(chu)現異(yi)常的(de)原因分(fen)析

     熒光(guang)定量(liang)PCR是(shi)生(sheng)物(wu)醫學(xue)中常(chang)用(yong)的(de)檢測(ce)核酸病毒的(de)方(fang)法之(zhi)壹(yi)，由(you)此，這幾年(nian)PCR 儀也成(cheng)了(le)近(jin)幾年(nian)臨(lin)床檢測(ce)和分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學(xue)研(yan)究(jiu)的(de)主(zhu)要(yao)實驗室(shi)設備(bei)。 我(wo)們知道CT值是(shi)PCR 擴增曲(qu)線(xian)中的(de)重要(yao)參數(shu)，那(na)麽CT值是(shi)什麽？它(ta)與(yu) PCR擴增存在(zai)什麽關(guan)系？為什(shen)麽有(you)的(de)時候基(ji)因(yin)擴增實(shi)驗中會(hui)出(chu)現 CT 值異(yi)常甚(shen)至(zhi)缺(que)少CT值的(de)情況？

什(shen)麽是(shi)CT值？

     在(zai)熒光(guang)定量(liang)PCR擴增實(shi)驗中，當(dang)擴增產(chan)物(wu)的(de)熒光信號（Fluorescence signal）達到(dao)設定(ding)的(de)熒光閾值（FLUORESCENCE threshold）時的(de)所對(dui)應的(de)擴增循(xun)環數（Cycle Threshold）。也可以(yi)理(li)解為在(zai)qPCR實驗過程(cheng)中初(chu)始(shi)模板(ban)擴增到(dao)壹(yi)定(ding)產物(wu)量(liang)值時，所對(dui)應的(de)循(xun)環數。 CT 值的(de)表達公(gong)式(shi)為：擴增產(chan)物(wu)量(liang)=起始(shi)模板(ban)量(liang)×（ 1+En）循(xun)環個數(shu)。

通常(chang)QPCR實(shi)驗中CT值的(de)異常主(zhu)要(yao)有(you)以(yi)下(xia)幾(ji)種情況：

 壹(yi)、擴增曲(qu)線(xian)正常(chang)，CT值偏(pian)大(da)或(huo)偏小(xiao)

從(cong)CT值表達公(gong)式(shi)中我(wo)們可(ke)以看出(chu)初(chu)始(shi)模板(ban)的(de)質(zhi)量(liang)和擴增效(xiao)率，會(hui)直接影響(xiang)到(dao)CT值的(de)大(da)小(xiao)。 如果(guo)擴增起(qi)始(shi)模板(ban)量(liang)濃度(du)高或(huo)引(yin)物(wu)設計(ji)不合適(shi)那(na)麽所用(yong)的(de)循(xun)環數就(jiu)會(hui)小，即出(chu)現Ct值過小(xiao)；反(fan)之(zhi)，起始(shi)模板(ban)量(liang)濃度(du)過低(di)，Ct值會(hui)偏大(da)。 PCR擴增效(xiao)率與(yu) CT 值也是(shi)成(cheng)反(fan)比關(guan)系，擴增效(xiao)率高則(ze)CT值小(xiao)，擴增效(xiao)率低(di)則(ze)需(xu)要(yao)要(yao)用(yong)到的(de)循(xun)環數增加所對(dui)應的(de)CT值也會(hui)偏高。另外(wai)，合理(li)的(de)引(yin)物(wu)設計(ji)，防汙(wu)染試劑(ji)的(de)應用(yong)也會(hui)影響(xiang)到(dao)CT值的(de)大(da)小(xiao)。

二(er)、 有(you)擴增曲(qu)線(xian)，但卻沒有(you)CT值，CT值顯示狀(zhuang)態(tai)為Undetermined

這種情況下(xia)妳(ni)通常(chang)也會(hui)發現由(you)於(yu)閥值位置(zhi)不正常(chang)正常(chang)導致熒光閾值線(xian)與(yu)擴增曲(qu)線(xian)沒有(you)交(jiao)點，所以儀(yi)器(qi)顯示狀(zhuang)態(tai)為Undetermined。出(chu)現這種如果(guo)擴增模板(ban)濃(nong)度是(shi)正常(chang)的(de)，那(na)麽多數(shu)原(yuan)因可能是(shi)由於(yu)系統(tong)界(jie)面參(can)數(shu)設(she)置(zhi)錯誤(wu)所導致的(de)。如果(guo)參與(yu)擴增的(de)模板(ban)並(bing)非所有(you)的(de)孔，而系(xi)統界(jie)面在(zai)所有(you)的(de) （ C-H行）都(dou)默(mo)認(ren) 設(she)上了(le)target和 sample 參與(yu)CT值計(ji)算。這個時候系(xi)統會(hui)默認(ren)所有(you)孔(kong)參(can)與(yu)熒(ying)光(guang)定(ding)量(liang) PCR 實驗 。導致CT值錯(cuo)誤(wu)。如(ru)果(guo)我們把(ba)無樣(yang)品(pin)C-H 行 數(shu)的(de)target和sample 前面的(de)“√" 清除(chu) 後重新分析(xi)計(ji)算，就(jiu)會(hui)得到正常(chang)的(de)熒光閾值線(xian) C T 值了(le)。

三、 有(you)擴增曲(qu)線(xian)，閾值線(xian)的(de)位置(zhi)也正常(chang)，但大(da)多數(shu)孔(kong)仍(reng)然不顯示CT值。

當(dang)系統(tong)界(jie)面C-H行 顯示出(chu)現異(yi)常提示（比如黃色(se)三角(jiao)形標示），在(zai)數據(ju)分(fen)析中會(hui)再很多孔(kong)內(nei)出(chu)現 BLFAIL提(ti)醒。這表明基(ji)線(xian)分(fen)析(xi)失(shi)敗，如果(guo)確定我(wo)們在(zai)反應物(wu)中加了(le)熒光(guang)染料(liao)，如(ru)果(guo)加了(le)，那(na)麽這種 熒光(guang)值偏(pian)低(di)現(xian)象，可(ke)能(neng)由(you)於(yu)使用(yong)了透(tou)光(guang)性不好(hao)PCR 耗(hao)材或不配(pei)套(tao)的(de)耗材所導致。這種情況較(jiao)容易(yi)出(chu)現在(zai)底部或(huo)側(ce)邊掃描檢測(ce)的(de)PCR 儀器中；朗(lang)基(ji)的(de) Q2000系列采用(yong)的(de)頂(ding)部CCD 實(shi)時檢測(ce)技術甚(shen)至(zhi)可以用(yong)*不透(tou)明(ming)的(de)白管(guan)進(jin)行實(shi)驗，所以壹(yi)般(ban)不會(hui)存在(zai)這種問(wen)題。

四、 還有(you)壹(yi)種情況較(jiao)為常(chang)見也就(jiu)是(shi)擴增曲(qu)線(xian)不正常(chang)，CT值都(dou)顯示“Undetermined"。 

此(ci)時，如果(guo)在(zai)熒光(guang)定量(liang)PCR檢測(ce)報告(gao)頁(ye)面出(chu)現了(le)ROX的(de)熒光值 為0的(de)情況，很(hen)可(ke)能(neng)是(shi)使用(yong)了不含ROX 試劑(ji)而系(xi)統(tong)參(can)數中未做(zuo)修改所造(zao)成(cheng)，及時在(zai)分析(xi)設置(zhi)中將 Passive reference dye的(de)ROX 改成(cheng)None，再重新分析(xi)即(ji)可正常(chang)顯示。有(you)些沒有(you)ROX 校(xiao)正的(de)PCR 儀中也較(jiao)容易(yi)出(chu)現此(ci)類問(wen)題。 

從上面(mian)Qpcr實驗中常(chang)幾種常遇(yu)到(dao)的(de)幾種情況中可(ke)以看出(chu)：要(yao)想獲得 準確的(de)pcr實驗結(jie)果(guo)，實驗的(de)設計及樣(yang)本、配套(tao)試劑(ji)耗材、儀器類型的(de)選擇、正確的(de)軟件操(cao)作(zuo)等都(dou)與(yu)實(shi)驗本身密不可(ke)分(fen)。

   蘇(su)州(zhou)阿爾(er)法(fa)生(sheng)物(wu)實驗器(qi)材有(you)限(xian)公(gong)司(si)13年(nian)專(zhuan)註(zhu)生(sheng)物(wu)實驗室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)和(he)試劑(ji)耗材 的(de)綜合供應包括(kuo)熒(ying)光定(ding)量(liang)PCR 儀、振(zhen)蕩培養箱(xiang)、生(sheng)物(wu)發酵罐、移(yi)液器(qi)等 ，廣(guang)泛(fan)應用(yong)於(yu)生(sheng)命(ming)科學(xue)、生(sheng)物(wu)制(zhi)藥(yao)、防疫檢測(ce) 、 科研(yan)等領域(yu)；以服務取(qu)勝(sheng)，以(yi)高(gao)性價(jia)比吸(xi)睛，阿爾(er)法(fa)從(cong)售前到售後，打造(zao)實驗室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)全服務鏈(lian)體系(xi)，滿(man)足客(ke)戶(hu)應用(yong)需求(qiu)。