動(dong)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)mRNA 提取試(shi)劑和(he)方法(fa)步(bu)驟

動(dong)物植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi)mRNA 提取試(shi)劑和(he)方法(fa)步(bu)驟

壹、實(shi)驗材(cai)料(liao)  水(shui)稻葉(ye)片或小(xiao)鼠肝(gan)組(zu)織(zhi)。 

二、實(shi)驗室儀器：  研缽(bo)，冷凍(dong)臺式高(gao)速離(li)心(xin)機(ji)，低溫冰(bing)箱，冷凍(dong)真空(kong)幹(gan)燥器，紫(zi)外(wai)檢測儀，電(dian)泳儀，電(dian)泳槽(cao)。

三(san)、實(shi)驗試(shi)劑
  1 、無(wu)  RNA  酶(mei)滅菌(jun)水(shui)：用將高(gao)溫烘(hong)烤(kao)的(de)玻(bo)璃(li)瓶(ping)（ 180 ℃  2  小(xiao)時）裝蒸餾水(shui)，然(ran)後(hou)加(jia)入(ru)  0.01% 的(de) DEPC （體(ti)積 / 體積），處理(li)過(guo)夜(ye)後(hou)高(gao)壓滅菌(jun)。 

2 、75% 乙(yi)醇(chun)：用  DEPC  處理(li)水(shui)配(pei)制(zhi)  75% 乙(yi)醇(chun)，（用高(gao)溫滅菌(jun)器皿配制(zhi)），然(ran)後(hou)裝(zhuang)入(ru)高(gao)溫烘(hong)烤(kao)的(de)玻(bo)  璃(li)瓶(ping)中(zhong)，存(cun)放於低溫冰(bing)箱。

3、 1 ×層析(xi)柱(zhu)加樣緩(huan)沖液(ye)； 20mmol/L Tris · Cl(pH7.6) ， 0.5mol/L NaCl ， 1mmol/L EDTA(pH8.0) ， 0.1% SDS 。

4、洗(xi)脫(tuo)緩(huan)沖液(ye)： 10mmol/L Tris · Cl (pH7.6) ， 0.05% SDS 。  

  四、動(dong)植(zhi)物(wu)總 RNA 提取操作步(bu)驟 

（壹）動(dong)植(zhi)物(wu)總  RNA 提取 -Trizol  法  Trizol  法適(shi)用於人(ren)類(lei)、動(dong)物、植(zhi)物(wu)、微(wei)生物(wu)的(de)組(zu)織(zhi)或培(pei)養(yang)細(xi)菌(jun)，樣品(pin)量從幾(ji)十(shi)毫克(ke)至(zhi)幾(ji)克(ke)。用  Trizol 法提取的(de)總 RNA 無(wu)蛋(dan)白(bai)和(he) DNA  汙染。 RNA 可直(zhi)接用於  Northern  斑點分(fen)析(xi)，斑點雜(za)交(jiao)， Poly(A)+  分(fen)離(li)，體(ti)外(wai)翻(fan)譯(yi)，RNase 封(feng)阻分(fen)析(xi)和(he)分(fen)子克(ke)隆(long)。

1、將組織(zhi)在液(ye)  N  中磨(mo)成(cheng)粉末後(hou)，再(zai)以(yi)  50-100mg  組織(zhi)加入(ru)  1ml Trizol  液(ye)研磨(mo)，註意(yi)樣品(pin)總體(ti)積  不能超(chao)過(guo)所用 Trizol  體積的(de)  10%。

2、研(yan)磨(mo)液(ye)室溫放(fang)置(zhi)  5 分(fen)鐘(zhong)，然(ran)後(hou)以(yi)每  1mlTrizol  液(ye)加入(ru)  0.2ml  的(de)比(bi)例加入(ru)氯仿(fang)，蓋緊離(li)心(xin)管(guan)，用  手劇(ju)烈(lie)搖(yao)蕩(dang)離(li)心(xin)管(guan) 15  秒(miao)。 

3 、取上(shang)層水(shui)相於壹新(xin)的(de)離(li)心(xin)管(guan)，按(an)每 mlTrizol  液(ye)加 0.5ml  異(yi)丙(bing)醇的(de)比(bi)例加入(ru)異丙(bing)醇，室溫放(fang)置(zhi)  10  分(fen)鐘(zhong)， 12000g  離(li)心  10  分(fen)鐘(zhong)。

4、棄去(qu)上清液(ye)，按每(mei)  ml Trizol  液(ye)加入(ru)至少(shao)  1ml  的(de)比(bi)例加入(ru)  75% 乙(yi)醇(chun)，渦旋混勻， 4 ℃下  7500g  離心  5  分(fen)鐘(zhong)。

5、小(xiao)心棄去(qu)上清液(ye)，然後(hou)室(shi)溫或(huo)真空(kong)幹(gan)燥  5-10  分(fen)鐘(zhong)，註(zhu)意(yi)不(bu)要幹(gan)燥過(guo)分(fen)，否(fou)則(ze)會(hui)降(jiang)低  RNA 的(de)  溶(rong)解(jie)度(du)。然後(hou)將  RNA  溶於水(shui)中(zhong)，必(bi)要時(shi)可  55 ℃ -60 ℃水(shui)溶(rong)  10  分(fen)鐘(zhong)。 RNA  可進行  mRNA  分(fen)離(li)，或(huo)貯(zhu) 存(cun)於 70%乙(yi)醇(chun)並(bing)保存(cun)於-70℃。

[註意(yi) ]

 1、整(zheng)個(ge)操(cao)作要戴(dai)口罩(zhao)及(ji)壹次(ci)性(xing)手(shou)套(tao)，並(bing)盡可能在低溫下(xia)操(cao)作。

2、加氯仿(fang)前的(de)勻漿液(ye)可在 -70 ℃保存(cun)壹個(ge)月(yue)以(yi)上， RNA  沈(chen)澱(dian)在  70% 乙(yi)醇(chun)中(zhong)可在  4 ℃保存(cun)壹周(zhou)， -20  ℃保存(cun)壹年。 

（二） mRNA 提取  由(you)於(yu)  mRNA  末(mo)端(duan)含有多  poly(A)+ ，當總  RNA  流徑  oligo(dT) 纖(xian)維(wei)素時，在高(gao)鹽(yan)緩(huan)沖液(ye)作用下，  mRNA 被特(te)異(yi)的(de)吸附在(zai)  oligo(dT) 纖(xian)維(wei)素柱(zhu)上，在(zai)低鹽(yan)濃(nong)度(du)或(huo)蒸(zheng)餾水(shui)中(zhong)， mRNA 可被洗(xi)下(xia)，經過(guo)兩(liang)次(ci) oligo(dT)  纖(xian)維(wei)素柱(zhu)，可得(de)到較純的(de)  mRNA 。

  1、用  0.1mol/L NaOH  懸(xuan)浮(fu)  0.5-1.0g oligo(dT) 纖(xian)維(wei)素。 

2 、將懸(xuan)浮(fu)液(ye)裝入(ru)滅菌(jun)的(de)壹(yi)次(ci)性(xing)層析(xi)柱(zhu)中或(huo)裝入(ru)填(tian)有經 DEPC  處理(li)並經高(gao)壓滅菌(jun)的(de)玻(bo)璃(li)棉(mian)的(de)巴斯(si) 德吸管(guan)中(zhong)，柱(zhu)床體(ti)積為  0.5-1.0ml，用  3  倍(bei)柱(zhu)床體(ti)積的(de)滅菌(jun)水(shui)沖洗(xi)柱(zhu)床。

3、用  1x  柱(zhu)層析(xi)加(jia)樣緩(huan)沖液(ye)沖洗(xi)柱(zhu)床，直(zhi)到流出液(ye)的(de)  pH 值(zhi)小(xiao)於  8.0 。 

4 、將（壹）中提取的(de) RNA  液(ye)於 65 ℃溫育(yu)  5  分(fen)鐘(zhong)後(hou)迅(xun)速(su)冷(leng)卻(que)至(zhi)室溫，加(jia)入(ru)等(deng)體積  2x  柱(zhu)層析(xi)緩(huan)沖  液(ye)，上樣，立即用滅菌(jun)試(shi)管(guan)收(shou)集(ji)洗(xi)出液(ye)，當所有  RNA 溶液(ye)進入柱(zhu)床後(hou)，加(jia)入(ru)  1 倍(bei)柱(zhu)床體(ti)積的(de)  1x  層(ceng)析(xi) 柱(zhu)加樣溶(rong)液(ye)。 

5 、測定每壹(yi)管(guan)的(de) OD260 ，當洗(xi)出液(ye)中  OD  為(wei)  0  時，加(jia)入  2-3  倍(bei)柱(zhu)床體(ti)積的(de)滅菌(jun)洗(xi)脫(tuo)緩(huan)沖液(ye)，以(yi) 1/3  至 1/2  柱(zhu)床體(ti)積分(fen)管(guan)收(shou)集(ji)洗(xi)脫(tuo)液(ye)。

6、測定  OD260 ，合並含有  RNA  的(de)洗(xi)脫(tuo)組(zu)分(fen)。

7、加(jia)入(ru)  1/10  體(ti)積的(de)  3M NaAc(pH5.2) ，  2.5  倍(bei)體積的(de)冰(bing)冷乙(yi)醇(chun)， 混勻，  -20 ℃ 30  分(fen)鐘(zhong)。

8、 4 ℃下(xia)  12000g  離心(xin)  15  分(fen)鐘(zhong)，小(xiao)心棄去(qu)上清液(ye)，用  70% 乙(yi)醇(chun)洗(xi) 滌(di)沈(chen)澱(dian)， 4 ℃下  12000g  離(li)心  5  分(fen)鐘(zhong)。

9、小(xiao)心棄去(qu)上清液(ye)，沈(chen)澱(dian)空(kong)氣幹燥  10 分(fen)鐘(zhong)，或(huo)真空(kong)幹(gan)燥  10  分(fen)鐘(zhong)。

10、用少量水(shui)溶(rong)解(jie)  RNA  液(ye)，即可用於  cDNA  合成(cheng)（或保存(cun)在  70% 乙(yi)醇(chun)中(zhong)並(bing)貯(zhu)存(cun)於 -70 ℃）。

當然，如果使用天根(gen)或碧(bi)雲天的(de)動(dong)植(zhi)物(wu)組(zu)織(zhi) mRNA 提取試(shi)劑盒也(ye)會(hui)省(sheng)去很(hen)多步(bu)驟，節約(yue)實(shi)驗耗材(cai)成(cheng)本(ben)。

[註(zhu)意(yi) ]

‍ 1、 mRNA 在(zai)  70% 乙(yi)醇(chun)中(zhong) -70 ℃可保存(cun)壹年以(yi)上。

2、 oligo(dT) 纖(xian)維(wei)素柱(zhu)用後(hou)可用  0.3mol/l NaOH  洗(xi)凈(jing)，然(ran)後(hou)用層析(xi)柱(zhu)加樣緩(huan)沖液(ye)平衡，並(bing)加(jia)入(ru)  0.02% 疊氮鈉(na)（ NaN3) 冰(bing)箱保存(cun)，重(zhong)復使用。每次(ci)用前需(xu)用 NaOH  水(shui)層(ceng)析(xi)柱(zhu)加樣緩(huan)沖液(ye)依次(ci)淋洗(xi)柱(zhu)床。