cDNA合(he)成技(ji)術(shu):從(cong)原理到操(cao)作流程的(de)全(quan)面(mian)指南(nan)

cDNA合(he)成是(shi)分(fen)子(zi)生(sheng)物學實驗中(zhong)的(de)基礎技術，它將(jiang)RNA逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)為互(hu)補DNA，廣泛(fan)應(ying)用(yong)於基因克(ke)隆、表達(da)分(fen)析等(deng)領(ling)域(yu)。本(ben)文將詳(xiang)細介(jie)紹(shao)cDNA合(he)成的(de)原理、方法(fa)及操作流程，幫(bang)助研究(jiu)人(ren)員掌握(wo)這(zhe)壹關(guan)鍵(jian)技(ji)術(shu)。

cDNA合(he)成的(de)基本(ben)原理

cDNA即互(hu)補DNA，是(shi)指(zhi)以(yi)信(xin)使RNA為模板，在(zai)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)作用(yong)下合(he)成的(de)DNA鏈(lian)。cDNA合(he)成包(bao)括第壹鏈(lian)合(he)成和第(di)二鏈(lian)合(he)成兩(liang)個(ge)關(guan)鍵(jian)步(bu)驟(zhou)。

第(di)壹鏈(lian)合(he)成

第(di)壹鏈(lian)合(he)成使用(yong)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)，以RNA為(wei)模板合(he)成互(hu)補DNA鏈(lian)。常(chang)用(yong)的(de)逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)包括M-MLV逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)和AMV逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)，其中(zhong)M-MLV逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)的(de)RNase H缺(que)失(shi)突(tu)變(bian)株能合(he)成更(geng)長的(de)cDNA。

引(yin)物選擇(ze)是(shi)關(guan)鍵(jian)環(huan)節(jie)，主(zhu)要(yao)分(fen)為(wei)三類(lei)：

Oligo(dT)引物：特異性(xing)結(jie)合(he)mRNA的(de)poly(A)尾(wei)，對(dui)mRNA有(you)高(gao)度特異性(xing)

隨機六(liu)聚(ju)體(ti)引(yin)物：適用(yong)於所(suo)有RNA模板，尤(you)其適合(he)含(han)有使反轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)終止(zhi)序列的(de)mRNA

序(xu)列特(te)異性(xing)引物：僅產生(sheng)目標cDNA，導致(zhi)更特(te)異的(de)PCR擴(kuo)增(zeng)

第二鏈(lian)合(he)成

第(di)二鏈(lian)合(he)成主(zhu)要(yao)有兩(liang)種方(fang)法(fa)：

自身引導法(fa)：合(he)成的(de)單(dan)鏈(lian)cDNA 3'端形成發夾(jia)結(jie)構(gou)，作為合(he)成第(di)二鏈(lian)的(de)引(yin)物。但該方法(fa)不易控(kong)制(zhi)，且用(yong)S1核酸(suan)酶(mei)切割(ge)發夾(jia)結(jie)構(gou)時易(yi)導(dao)致(zhi)mRNA 5'端序列缺(que)失(shi)和重(zhong)排。

置換(huan)合(he)成法(fa)：利用(yong)RNase H在(zai)DNA-RNA雜(za)交(jiao)鏈(lian)的(de)mRNA上造(zao)成切口和缺(que)口，產(chan)生(sheng)RNA引(yin)物，再在(zai)大腸桿(gan)菌DNA聚(ju)合(he)酶(mei)I作用(yong)下合(he)成第(di)二鏈(lian)。該(gai)方(fang)法(fa)非常有效(xiao)，可直(zhi)接(jie)利用(yong)第壹鏈(lian)反(fan)應(ying)產物，無(wu)需(xu)進壹步(bu)處(chu)理和純化(hua)，且不必使用(yong)S1核酸(suan)酶(mei)。

Riboclone M-MLV(H-) cDNA合(he)成技(ji)術(shu)詳(xiang)解(jie)

系統組(zu)成

該(gai)系(xi)統(tong)的(de)試(shi)劑(ji)包(bao)括：

特異(yi)性(xing)引物

M-MLV第壹鏈(lian)緩(huan)沖(chong)液(5×)

rRNasin RNA酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)

M-MLV反(fan)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)，RNase H-

對(dui)照(zhao)RNA

M-MLV第(di)二鏈(lian)緩(huan)沖(chong)液(10×)

RNase H

DNA聚(ju)合(he)酶(mei)Ⅰ

T4 DNA聚(ju)合(he)酶(mei)Ⅰ

不含(han)核酸(suan)酶(mei)的(de)水

操作步(bu)驟(zhou)

第(di)壹鏈(lian)合(he)成

在(zai)無(wu)菌(jun)無(wu)RNA酶(mei)的(de)離(li)心管(guan)中加入RNA模板和適當(dang)引(yin)物（每μg RNA使用(yong)0.5μg引物），用(yong)H₂O調整體積至15μl。

70℃處(chu)理5分(fen)鐘(zhong)，冷(leng)卻(que)至室(shi)溫(wen)，離心。

依次(ci)加入5×第(di)壹鏈(lian)緩(huan)沖(chong)液5μl、rRNasin RNA酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)25U、M-MLV(H-)反(fan)轉(zhuan)錄(lu)酶(mei)200U，用(yong)H₂O調至(zhi)總體(ti)積25μl。

輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，取(qu)出5μl至另(ling)壹管(guan)中加入[α-³²P] dCTP，用(yong)於同(tong)位(wei)素(su)摻(chan)入(ru)放(fang)射性(xing)活性(xing)測定(ding)。

37℃（隨機引物）或(huo)42℃（其他引物）溫(wen)浴1小(xiao)時。

第(di)二鏈(lian)合(he)成

取(qu)第(di)壹鏈(lian)反(fan)應(ying)液20μl，依次(ci)加入10×第(di)二鏈(lian)緩(huan)沖(chong)液20μl、DNA聚(ju)合(he)酶(mei)Ⅰ23U、RNase H 0.8U，加H₂O至終(zhong)體(ti)積100μl。

輕(qing)輕(qing)混(hun)勻，如(ru)需(xu)進行(xing)第二鏈(lian)同(tong)位(wei)素(su)摻(chan)入(ru)測定(ding)，可取出(chu)10μl加入[α-³²P] dCTP。

14℃溫(wen)浴2小(xiao)時（如(ru)需(xu)合(he)成長於3kb的(de)cDNA，則(ze)需(xu)延長至3-4小時）。

70℃處(chu)理10分(fen)鐘(zhong)，低速離(li)心後(hou)置冰(bing)上。

加入2U T4 DNA聚(ju)合(he)酶(mei)，37℃溫(wen)浴10分(fen)鐘(zhong)。

加入10μl 200mmol/L EDTA終(zhong)止(zhi)反應(ying)。

用(yong)等體(ti)積酚:氯(lv)仿(fang)抽提，乙醇沈(chen)澱(dian)，幹(gan)燥後(hou)溶(rong)於(yu)TE緩(huan)沖(chong)液。

合(he)成產(chan)物定(ding)量分(fen)析

通(tong)過同(tong)位(wei)素(su)摻(chan)入(ru)放(fang)射性(xing)活性(xing)測定(ding)，可以計算(suan)cDNA合(he)成量(liang)：

第壹鏈(lian)產(chan)量(liang)測定(ding)：

第壹鏈(lian)摻(chan)入(ru)率(lv)(%) = 摻(chan)入(ru)cpm/總(zong)cpm × 100%

摻(chan)入(ru)dNTP量(liang)(nmol) = 2 nmol dNTP/μl × 反應(ying)體積(μl) × 第壹鏈(lian)摻(chan)入(ru)率(lv)

合(he)成cDNA量(liang)(ng) = 摻(chan)入(ru)dNTP (nmol) × 330 ng/nmol

mRNA向(xiang)cDNA轉(zhuan)變(bian)率 = 合(he)成cDNA量(liang)(ng) / 模板RNA量(liang)(ng) × 100%

第二鏈(lian)產(chan)量(liang)計算(suan)：

第(di)二鏈(lian)摻(chan)入(ru)率(lv) = 摻(chan)入(ru)放(fang)射性(xing)活性(xing)/總放(fang)射性(xing)活性(xing)

摻(chan)入(ru)dNTP量(liang)(nmol) = [0.4 nmol dNTP/μl × 反應(ying)體積(μl) - 第壹鏈(lian)摻(chan)入(ru)nmol] × 第(di)二鏈(lian)摻(chan)入(ru)率(lv)

第二鏈(lian)cDNA合(he)成量(liang)(ng) = nmol dNTP × 330 ng/nmol

雙(shuang)鏈(lian)cDNA轉(zhuan)變(bian)率 = 雙(shuang)鏈(lian)cDNA合(he)成量(liang)(ng) / 單(dan)鏈(lian)cDNA合(he)成量(liang)(ng)

壹般(ban)cDNA第壹鏈(lian)轉(zhuan)變(bian)率和雙(shuang)鏈(lian)轉(zhuan)變(bian)率以12-50%和50-200%為(wei)好。

cDNA合(he)成技(ji)術(shu)的(de)創新(xin)進展

新型DNA合(he)成技(ji)術(shu)

近(jin)年(nian)來，DNA合(he)成技(ji)術(shu)不斷(duan)創新(xin)。華(hua)大生(sheng)命(ming)科(ke)學研究(jiu)院(yuan)研發的(de)基於並行(xing)原理的(de)DNA合(he)成技(ji)術(shu)（mMPS）采(cai)用(yong)"微芯(xin)片"創新(xin)範(fan)式，在(zai)合(he)成通(tong)量、產(chan)量和質(zhi)量(liang)上實(shi)現(xian)了系(xi)統(tong)性(xing)突破(po)。該技術將(jiang)芯(xin)片分(fen)為(wei)獨立的(de)毫(hao)米級(ji)微芯(xin)片，每(mei)個(ge)微芯(xin)片上僅(jin)合(he)成壹條短鏈(lian)DNA，且表面(mian)帶(dai)有(you)專(zhuan)屬(shu)識(shi)別(bie)碼(ma)，可對(dui)DNA片(pian)段進行(xing)身份(fen)識(shi)別(bie)與(yu)分(fen)選。

環(huan)狀(zhuang)RNA合(he)成技(ji)術(shu)

國家衛(wei)生(sheng)研究(jiu)院(yuan)開發出(chu)壹種新(xin)型環(huan)狀(zhuang)RNA合(he)成法(fa)，利用(yong)連接(jie)酶(mei)核酶(mei)將線(xian)性(xing)RNA環化(hua)，生(sheng)成環(huan)狀(zhuang)RNA。這(zhe)種(zhong)環(huan)狀RNA具有較(jiao)高(gao)的(de)穩(wen)定(ding)性(xing)，對(dui)核(he)酸(suan)外(wai)切酶(mei)的(de)降(jiang)解(jie)有更強(qiang)的(de)抵(di)抗(kang)力，明顯(xian)延長了RNA的(de)作用(yong)時間，同時(shi)降(jiang)低了RNA的(de)使用(yong)劑(ji)量(liang)。

AI技(ji)術(shu)在(zai)DNA設計中(zhong)的(de)應(ying)用(yong)

科(ke)學家們(men)現(xian)在(zai)利用(yong)生(sheng)成式人(ren)工智(zhi)能設(she)計合(he)成DNA序(xu)列，作為"基因開(kai)關(guan)"控(kong)制(zhi)哺(bu)乳動物特定(ding)細胞中(zhong)的(de)基因表達(da)。這(zhe)種(zhong)技(ji)術可根(gen)據(ju)特(te)定(ding)需(xu)求，從(cong)零(ling)開(kai)始(shi)"創作"自然界中不存(cun)在(zai)的(de)DNA片(pian)段，為(wei)基因治療提供了新的(de)工(gong)具(ju)。

cDNA合(he)成註意事(shi)項

RNA模板質(zhi)量(liang)：RNA的(de)完(wan)整性(xing)對(dui)cDNA合(he)成至(zhi)關(guan)重(zhong)要(yao)。需(xu)使用(yong)高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)無(wu)降(jiang)解(jie)RNA，可通(tong)過瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電泳檢(jian)測28S/18S rRNA條帶比例(li)（比值≥1.5）評(ping)估(gu)RNA完(wan)整性(xing)。

RNase汙染控(kong)制(zhi)：在(zai)整個(ge)實驗(yan)過(guo)程中需(xu)使用(yong)無(wu)RNase汙染的(de)試(shi)劑(ji)和耗(hao)材(cai)，通(tong)常在(zai)合(he)成第(di)壹鏈(lian)反(fan)應(ying)體系(xi)中加入RNA酶(mei)抑制(zhi)劑(ji)以(yi)抑(yi)制(zhi)RNA酶(mei)活性(xing)。

引物選擇(ze)：根(gen)據(ju)實(shi)驗需(xu)求選擇(ze)合(he)適的(de)引(yin)物。Oligo(dT)引物對(dui)mRNA有(you)特(te)異(yi)性(xing)，隨機引物適用(yong)於全(quan)轉(zhuan)錄(lu)組分(fen)析，序(xu)列特(te)異性(xing)引物則(ze)用(yong)於特(te)定(ding)基因的(de)cDNA合(he)成。

溫(wen)度條(tiao)件：逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)溫(wen)度對(dui)結(jie)果(guo)有(you)顯(xian)著影(ying)響。使用(yong)隨機引物時通(tong)常在(zai)37℃進行(xing)反應(ying)，而使用(yong)其他引物時可在(zai)42℃進行(xing)。

應(ying)用(yong)領(ling)域(yu)

cDNA合(he)成技(ji)術(shu)在(zai)多個(ge)領(ling)域(yu)有(you)廣泛(fan)應(ying)用(yong)：

基因表達(da)分(fen)析：通(tong)過逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)實時(shi)熒(ying)光(guang)定(ding)量PCR分(fen)析特(te)定(ding)基因的(de)表達(da)水平(ping)。

病(bing)毒(du)檢測：在(zai)臨床診斷(duan)中(zhong)，cDNA合(he)成是(shi)檢(jian)測RNA病(bing)毒(du)（如(ru)新冠病(bing)毒(du)）的(de)關(guan)鍵(jian)步(bu)驟(zhou)。

cDNA文庫(ku)構(gou)建：用(yong)於研究(jiu)細胞或(huo)組(zu)織在(zai)特定(ding)狀態(tai)下(xia)的(de)基因表達(da)譜。

基因克(ke)隆：克(ke)隆真(zhen)核生(sheng)物基因在(zai)原核系統中(zhong)表達(da)。

蘇州阿爾法(fa)生(sheng)物提供cDNA合(he)成所(suo)需(xu)的(de)PCR試(shi)劑(ji)、逆(ni)轉(zhuan)錄(lu)試劑(ji)盒(he)、Taq DNA聚(ju)合(he)酶(mei)等高(gao)質(zhi)量(liang)試(shi)劑(ji)，滿(man)足(zu)各(ge)類(lei)分(fen)子(zi)生(sheng)物學實驗需(xu)求。我(wo)們(men)的(de)試(shi)劑(ji)經(jing)過(guo)嚴(yan)格(ge)質(zhi)量(liang)控(kong)制(zhi)，確保(bao)實驗的(de)準(zhun)確性(xing)和可(ke)重(zhong)復性(xing)，為您(nin)的(de)科(ke)研工作提供(gong)有力(li)支持。