​ 質粒 DNA 少量快(kuai)速(su)提(ti)取(qu)實(shi)驗方案

壹(yi)、材料(liao)、設(she)備(bei)及(ji)試劑

（壹）材料(liao)

含 pBS 的(de) E. coli DH5α 或(huo) JM 系(xi)列菌(jun)株(zhu)，1.5ml 塑料(liao)離(li)心(xin)管 (又(you)稱(cheng) eppendorf 管)，離(li)心(xin)管架。

（二）設(she)備(bei)

微(wei)量(liang)取(qu)液器(qi) (20μl,200μl,1000μl)，臺(tai)式(shi)高(gao)速(su)離心(xin)機，恒溫(wen)振蕩(dang)搖(yao)床，高(gao)壓(ya)蒸汽(qi)消(xiao)毒器(qi) (滅菌鍋(guo))，渦(wo)旋(xuan)振蕩器，電(dian)泳儀(yi)，瓊脂(zhi)糖(tang)平(ping)板(ban)電(dian)泳裝置和恒溫(wen)水(shui)浴鍋等。

（三）試劑

1. LB 液體(ti)培(pei)養基(ji) (Luria-Bertani)：稱(cheng)取(qu)蛋(dan)白(bai)腖(dong) (Tryptone) 10g，酵母(mu)提(ti)取(qu)物 (Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶(rong)於 800ml 去(qu)離子水(shui)中，用 NaOH 調(tiao) pH 至 7.5，加(jia)去(qu)離(li)子水(shui)至總(zong)體(ti)積(ji) 1 升(sheng)，高(gao)壓(ya)下(xia)蒸氣滅菌 20 分(fen)鐘。

2. LB 固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)：液體(ti)培(pei)養基(ji)中每升(sheng)加(jia) 12g 瓊脂(zhi)粉(fen)，高(gao)壓(ya)滅菌。

3. 氨(an)芐青黴素(su) (Ampicillin, Amp) 母(mu)液：配(pei)成(cheng) 50mg/ml 水(shui)溶(rong)液，-20℃保(bao)存備(bei)用(yong)。

4. 溶(rong)菌酶(mei)溶(rong)液：用(yong) 10mmol/L Tris・Cl (pH8.0) 溶(rong)液配(pei)制(zhi)成(cheng) 10mg/ml，並(bing)分裝成(cheng)小份(fen) (如(ru) 1.5ml) 保(bao)存於 - 20℃，每壹(yi)小份(fen)壹(yi)經(jing)使用(yong)後(hou)便(bian)予(yu)丟(diu)棄。

5. 3mol/l NaAc (pH5.2)：50ml 水(shui)中溶(rong)解 40.81g NaAc・3H2O，用(yong)冰醋酸調(tiao) pH 至 5.2，加(jia)水(shui)定(ding)容(rong)至 100ml，分(fen)裝後(hou)高壓(ya)滅菌，儲(chu)存於 4℃冰(bing)箱(xiang)。

6. 溶(rong)液 Ⅰ：50mmol/L 葡(pu)萄糖，25mmol/L Tris.Cl (pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)。溶(rong)液 Ⅰ 可成(cheng)批(pi)配制(zhi)，每瓶(ping) 100ml，高(gao)壓(ya)滅菌 15 分(fen)鐘，儲存於 4℃冰(bing)箱(xiang)。

7. 溶(rong)液 Ⅱ：0.2mol/L NaOH (臨(lin)用(yong)前用(yong) 10mol/L NaOH 母(mu)液稀(xi)釋(shi))，1％SDS。

8. 溶(rong)液 Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，冰(bing)醋酸 11.5ml，H2O 28.5ml，定(ding)容(rong)至 100ml，並(bing)高壓(ya)滅菌。溶(rong)液終濃(nong)度(du)為：K+ 3mol/L，Acˉ 5mol/L。

9. RNA 酶(mei) A 母(mu)液：將 RNA 酶(mei) A 溶(rong)於 10mmol/L Tris・Cl (pH7.5)，15mmol/L NaCl 中，配成(cheng) 10mg/ml 的(de)溶(rong)液，於(yu) 100℃加(jia)熱 15 分鐘(zhong)，使混(hun)有的(de) DNA 酶(mei)失(shi)活(huo)。冷(leng)卻後(hou)用(yong) 1.5ml eppendorf 管分裝成(cheng)小份(fen)保(bao)存於 - 20℃。

10. 飽(bao)和酚：市(shi)售酚(fen)中含有醌等氧(yang)化(hua)物，這(zhe)些產(chan)物可引起磷(lin)酸(suan)二(er)酯(zhi)鍵的(de)斷裂及(ji)導(dao)致 RNA 和 DNA 的交(jiao)聯，應在(zai) 160℃用(yong)冷(leng)凝管(guan)進行(xing)重(zhong)蒸。重(zhong)蒸酚加(jia)入(ru) 0.1％的 8 - 羥基(ji)喹啉(lin) (作為抗氧(yang)化(hua)劑(ji))，並用等體積(ji)的(de) 0.5mol/L Tris・Cl (pH8.0) 和 0.1mol/L Tris・Cl (pH8.0) 緩(huan)沖液反(fan)復(fu)抽(chou)提(ti)使(shi)之飽(bao)和並使(shi)其 pH 值(zhi)達(da)到 7.6 以(yi)上(shang)，因為酸性條件(jian)下(xia) DNA 會分配(pei)於(yu)有機(ji)相。

11. 氯(lv)仿(fang)：按(an)氯(lv)仿(fang)：異(yi)戊(wu)醇(chun)＝24:1 體積(ji)比加(jia)入(ru)異戊(wu)醇(chun)。氯仿(fang)可使蛋(dan)白(bai)變(bian)性並有助(zhu)於(yu)液相與有機(ji)相的(de)分(fen)開，異(yi)戊(wu)醇(chun)則(ze)可起消除抽(chou)提(ti)過(guo)程中出現(xian)的(de)泡沫。按(an)體(ti)積(ji) / 體(ti)積(ji)＝1:1 混(hun)合(he)上述(shu)飽(bao)和酚與氯仿(fang)即得(de)酚 / 氯仿(fang) (1:1)。酚(fen)和氯仿(fang)均(jun)有很強(qiang)的腐(fu)蝕性，操(cao)作(zuo)時(shi)應戴(dai)手(shou)套(tao)。

12. TE 緩(huan)沖液：10mmo/L Tris・Cl (pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。高(gao)壓(ya)滅菌後(hou)儲存於 4℃冰(bing)箱(xiang)中。

13. STET：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，10mmol/L EDTA (pH8.0)，5% Triton X-100。

14. STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L Tris·Cl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。

15. 電(dian)泳所用(yong)試劑：（1）TBE 緩(huan)沖液 (5×)：稱(cheng)取(qu) Tris 54g，硼(peng)酸 27.5g，並加(jia)入(ru) 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml，定(ding)溶(rong)至 1000ml。（2）上(shang)樣(yang)緩(huan)沖液 (6×)：0.25% 溴(xiu)酚(fen)藍，40% (w/v) 蔗(zhe)糖水(shui)溶(rong)液。

二(er)、操(cao)作(zuo)步(bu)驟

（壹(yi)）細(xi)菌的培養和收集

將含有質粒 pBS 的 DH5α 菌種接種在(zai) LB 固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基(ji) (含 50μg/ml Amp) 中，37℃培養(yang) 12-24 小時(shi)。用無(wu)菌牙簽(qian)挑取(qu)單(dan)菌(jun)落接種到 5ml LB 液體(ti)培(pei)養基(ji) (含 50μg/ml Amp) 中，37℃振蕩(dang)培(pei)養約 12 小時(shi)至對數生(sheng)長後(hou)期。

（二(er)）質粒 DNA 少量快(kuai)速(su)提(ti)取(qu)

質粒 DNA 小量(liang)提(ti)取(qu)法對於從(cong)大量(liang)轉化(hua)子中制(zhi)備(bei)少(shao)量(liang)部(bu)分純化(hua)的(de)質粒 DNA 十(shi)分(fen)有用(yong)。這(zhe)些方法共(gong)同(tong)特(te)點(dian)是簡(jian)便(bian)、快(kuai)速(su)，能(neng)同(tong)時(shi)處理大量(liang)試樣(yang)，所得(de) DNA 有壹(yi)定(ding)純(chun)度(du)，可滿足(zu)限(xian)制(zhi)酶(mei)切割(ge)、電(dian)泳分(fen)析(xi)的需要(yao)。

1. 煮沸(fei)法

1. 將 1.5ml 培(pei)養液倒入(ru) eppendorf 管中，4℃下(xia) 12000ｇ離心(xin) 30 秒。

2. 棄上清(qing)，將管(guan)倒置於衛生(sheng)紙上(shang)幾分(fen)鐘(zhong)，使液體(ti)流盡。

3. 將菌(jun)體沈(chen)澱懸(xuan)浮(fu)於(yu) 120ml STET 溶(rong)液中，渦(wo)旋(xuan)混(hun)勻。

4. 加(jia)入(ru) 10ml 新配(pei)制(zhi)的(de)溶(rong)菌酶(mei)溶(rong)液 (10mg/ml)，渦(wo)旋(xuan)振蕩 3 秒鐘(zhong)。

5. 將 eppendorf 管(guan)放入(ru)沸水(shui)浴中，50 秒後(hou)立(li)即取(qu)出(chu)。

6. 用微(wei)量(liang)離心(xin)機 4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 10 分鐘。

7. 用無(wu)菌牙簽(qian)從(cong) eppendorf 管(guan)中去除細(xi)菌碎片(pian)。

8. 取(qu) 20ml 進行(xing)電(dian)泳檢(jian)查(zha)。

[註意(yi)] 1. 對大腸桿菌可從(cong)固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)上挑取(qu)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)直(zhi)接進行(xing)煮沸(fei)法提(ti)取(qu)質粒 DNA。

2. 煮沸(fei)法中添(tian)加(jia)溶(rong)菌酶(mei)有壹(yi)定(ding)限(xian)度(du)，濃(nong)度(du)高時(shi)，細(xi)菌裂解(jie)效果反而不好。有時(shi)不同(tong)溶(rong)菌酶(mei)也能(neng)溶(rong)菌。

3. 提(ti)取(qu)的(de)質粒 DNA 中會含有 RNA，但(dan) RNA 並(bing)不幹(gan)擾(rao)進壹(yi)步(bu)實驗(yan)，如(ru)限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)消(xiao)化(hua)、亞(ya)克隆(long)及連接反(fan)應等。

2. 堿法

1. 取(qu) 1.5ml 培(pei)養液倒入(ru) 1.5ml eppendorf 管中，4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 30 秒。

2. 棄上清(qing)，將管(guan)倒置於衛生(sheng)紙上(shang)數分(fen)鐘(zhong)，使液體(ti)流盡。

3. 菌體沈(chen)澱重(zhong)懸浮於 100μl 溶(rong)液 Ⅰ 中 (需劇(ju)烈振(zhen)蕩(dang))，室(shi)溫(wen)下(xia)放置 5-10 分鐘。

4. 加(jia)入(ru)新配(pei)制(zhi)的(de)溶(rong)液 Ⅱ200μl，蓋(gai)緊(jin)管(guan)口(kou)，快速(su)溫和顛倒 eppendorf 管數次，以(yi)混(hun)勻內(nei)容(rong)物 (千(qian)萬(wan)不要振(zhen)蕩(dang))，冰浴 5 分鐘(zhong)。

5. 加(jia)入(ru) 150μl 預(yu)冷(leng)的溶(rong)液 Ⅲ，蓋(gai)緊(jin)管(guan)口(kou)，並倒置離心(xin)管，溫和振蕩(dang) 10 秒，使(shi)沈(chen)澱混(hun)勻，冰(bing)浴中 5-10 分鐘(zhong)，4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 5-10 分鐘。

6. 上清(qing)液移(yi)入(ru)幹(gan)凈(jing) eppendorf 管中，加(jia)入(ru)等體積(ji)的(de)酚(fen) / 氯(lv)仿(fang) (1:1)，振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻，4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 5 分鐘。

7. 將水(shui)相移(yi)入(ru)幹(gan)凈(jing) eppendorf 管中，加(jia)入(ru) 2 倍體(ti)積(ji)的(de)無(wu)水(shui)乙醇(chun)，振(zhen)蕩(dang)混(hun)勻後(hou)置於 - 20℃冰箱中 20 分鐘(zhong)，然(ran)後(hou) 4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 10 分鐘。

8. 棄上(shang)清，將管(guan)口(kou)敞開倒置於衛生(sheng)紙上(shang)使所有液體(ti)流出，加(jia)入(ru) 1ml 70％乙醇(chun)洗(xi)沈(chen)澱壹(yi)次，4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 5-10 分鐘。

9. 吸(xi)除上清(qing)液，將管(guan)倒置於衛生(sheng)紙上(shang)使液體(ti)流盡，真空(kong)幹(gan)燥 10 分鐘(zhong)或(huo)室溫(wen)幹(gan)燥。

10. 將沈(chen)澱溶(rong)於 20μl TE 緩(huan)沖液 (pH8.0，含 20μg/ml RNaseA) 中，儲於(yu) - 20℃冰(bing)箱中。

[註意(yi)] 1. 提(ti)取(qu)過(guo)程應盡量保(bao)持(chi)低(di)溫(wen)。

2. 提(ti)取(qu)質粒 DNA 過(guo)程中除去蛋(dan)白(bai)很重(zhong)要，采用酚(fen) / 氯(lv)仿(fang)去(qu)除蛋(dan)白(bai)效果較(jiao)單(dan)獨(du)用酚(fen)或(huo)氯仿(fang)好，要(yao)將蛋(dan)白(bai)盡量除幹(gan)凈(jing)需多次抽(chou)提(ti)。

3. 沈(chen)澱 DNA 通(tong)常使(shi)用(yong)冰(bing)乙(yi)醇，在(zai)低(di)溫(wen)條(tiao)件(jian)下(xia)放置時(shi)間稍長可使 DNA 沈(chen)澱。沈(chen)澱 DNA 也可用異丙(bing)醇(chun) (壹(yi)般(ban)使(shi)用(yong)等體積(ji))，且(qie)沈(chen)澱全(quan)，速(su)度(du)快，但(dan)常把(ba)鹽(yan)沈(chen)澱下(xia)來，所以(yi)多數還是用(yong)乙醇。

3. Wizard 少(shao)量(liang) DNA 純化(hua)系(xi)統(tong)

Promega 公司的 Wizard 少(shao)量 DNA 純(chun)化(hua)系(xi)統(tong)可快速(su)有效的抽(chou)提(ti)質粒 DNA，整個(ge)過(guo)程只需 15 分(fen)鐘(zhong)。提(ti)取(qu)的(de)質粒可直(zhi)接用(yong)於 DNA 測序、酶(mei)切分析(xi)和體外(wai)轉錄(lu)等。

該系(xi)統(tong)中所含試劑和柱子可以(yi)用(yong)於 50 次 1-3ml 質粒培養液的(de)分(fen)離和純化(hua)，試劑包括 10ml 細(xi)胞(bao)懸浮(fu)液，10ml 細(xi)胞(bao)裂解(jie)液；10ml 中和液，50ml Wizard 少(shao)量(liang) DNA 純化(hua)樹(shu)脂(zhi)，50ml 柱洗(xi)液（使(shi)用(yong)前加(jia) 95% 乙(yi)醇(chun)至 120ml) 和 50 支(zhi) Wizard 微(wei)型(xing)柱。

1. 1-3ml 過(guo)夜培(pei)養細(xi)胞(bao)液 4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 1-2 分鐘。

2. 去除上清(qing)液，菌(jun)體(ti)細(xi)胞(bao)懸浮(fu)於(yu) 200μl 細(xi)胞(bao)懸浮(fu)液中，充分(fen)混(hun)合(he)，並移(yi)入(ru) eppendorf 管中。

3. 加(jia) 200μl 細(xi)胞(bao)裂解(jie)液，顛倒離心(xin)管數次，直(zhi)到溶(rong)液變(bian)清(qing)亮。

4. 加(jia) 200μl 中和液，顛倒離心(xin)管數次。

5. 4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 5 分鐘，取(qu)上(shang)清液於(yu)新(xin)的 eppendorf 管(guan)中。

6. 加(jia) 1ml Wizard 少(shao)量(liang) DNA 純(chun)化(hua)樹(shu)脂(zhi)，顛倒離心(xin)管數次以(yi)充(chong)分混(hun)勻。

7. 取(qu)壹(yi)次性註射(she)器，取(qu)出(chu)註塞，並使(shi)註(zhu)射(she)筒(tong)與 Wizard 微(wei)型(xing)柱連接，用(yong)移液槍(qiang)將上(shang)述混(hun)合(he)液加(jia)入(ru)註射(she)筒(tong)中，並用(yong)註(zhu)塞輕推(tui)，使(shi)混(hun)合(he)物進入(ru)微(wei)型(xing)柱。

8. 將註(zhu)射(she)器與微(wei)型(xing)柱分開，取(qu)出(chu)註塞，再(zai)將註(zhu)射(she)筒(tong)與微(wei)型(xing)柱相連，加(jia)入(ru) 2ml 柱洗(xi)液，並(bing)用(yong)註塞(sai)輕推(tui)，使(shi)柱洗(xi)液進入(ru)微(wei)型(xing)柱。

9. 取(qu)出(chu)微(wei)型(xing)柱置於 eppendorf 管中，離心(xin) 2 分鐘以(yi)除去微(wei)型(xing)柱中的柱洗(xi)液。

10. 將微(wei)型(xing)柱放在(zai)壹(yi)個(ge)新(xin) eppendorf 管(guan)中，加(jia) 50μl TE (或(huo)水(shui)) 於微(wei)型(xing)柱中，靜止(zhi) 1 分(fen)鐘後，4℃下(xia) 12000g 離心(xin) 20 秒。

11. 丟(diu)棄微(wei)型(xing)柱，將 eppendorf 管(guan)中的質粒 DNA 貯於 4℃或(huo) - 20℃冰箱(xiang)。

[註意(yi)] 樹(shu)脂(zhi)使(shi)用(yong)前應充(chong)分混(hun)勻，如(ru)有結(jie)晶(jing)，可將樹(shu)脂(zhi)用(yong) 25-37℃水(shui)浴處理(li) 10 分(fen)鐘(zhong)。