PCR 產(chan)物(wu)純化(hua)方(fang)法（酚(fen)/氯(lv)仿）:
1. 取(qu) PCR 產物（此(ci)次(ci)為 200 ul），加(jia)入 50 ul 酚，加入 50 ul 氯(lv)仿/異(yi)戊醇（分(fen)相上層(ceng)應(ying)該(gai)是(shi)澄清(qing)的，如果(guo)不(bu)是(shi)澄
清(qing)，可(ke)以再(zai)次(ci)離心 5 min，將澄(cheng)清(qing)上清(qing)取(qu)出）；
2. 劇烈(lie)振(zhen)蕩（100 bp 的小片斷(duan)沒有(you)必要(yao)劇烈(lie)振(zhen)蕩），混勻(yun)後，離心 6000－8000 轉（壹般(ban)大片斷(duan)離心 10000 rpm），
5 min。（只能離心 5 min，過(guo)久的話就(jiu)會(hui)酚(fen)變成沈澱(dian)）；
3. 取(qu)上請，不(bu)要(yao)吸(xi)到中間(jian)箱，吸(xi)取(qu)後再(zai)在棄液中加(jia)入雙(shuang)蒸(zheng)水，再(zai)次(ci)離心，收集(ji)上清(qing)，反復(fu)兩次(ci)；
4. 上請 2 倍(bei)體積(ji)的 100％乙醇以及 0.2 倍體積(ji)的 NaAc 沈澱(dian)，-20oC（1 h 也(ye)可(ke)以）過(guo)夜沈澱(dian)（異(yi)丙醇效果(guo)更(geng)好，
但是(shi)不(bu)純）；
5. 12000 轉，離心 20min，棄去(qu)上請。70％乙(yi)醇清(qing)洗壹次(ci)，離心，12000 rpm，10 min，重(zhong)復洗(xi)滌(di) 1－2 次(ci)（多(duo)
洗(xi)幾(ji)次(ci)除去(qu)酚雜質(zhi)）；
6. 棄去(qu)乙醇，充分(fen)晾(liang)幹(gan)，雙(shuang)蒸(zheng)水融解。
2.13. 大腸桿(gan)菌(jun)菌落 PCR
1．取(qu)適量 PCR 薄(bo)壁管(guan)，置(zhi)於冰上，每(mei)管(guan)先(xian)加入 17.3ul 的滅(mie)菌(jun)水(shui)。
2．用滅(mie)過(guo)菌(jun)的 10ul 小槍頭挑取(qu)單克(ke)隆(long)白斑(ban)至(zhi)滅(mie)菌(jun)水(shui)中，振(zhen)蕩混勻(yun)。
3．依次(ci)加入：
10xBuffer 2.5
MgCl2（25mM） 1.8
DNTP（2.5mM） 1
T3 引物（10pmol） 1
T7 引(yin)物(wu)（10pmol） 1 33
Taq 酶 0.4
Total 25ul
各(ge)試劑(ji)均加好(hao)後，離心機上甩壹下(xia)，使(shi)之沈底(di)，置(zhi)於 PCR 儀(yi)上
4． 94℃ 2 min
94℃ 4 min
94℃ 40 s
53.6℃ 40 s，35 個(ge)循環
72℃ 4 min
72℃ 10 min
4℃ 24 h
5．待 PCR 反應(ying)進入 4℃後，取(qu)下 PCR 薄壁管(guan)，取(qu) 7ulPCR 產物加(jia)入 3ul 溴芬蘭(lan)跑(pao)電(dian)泳(yong)，同(tong)時(shi)上 1Kb DNA ladder。
半(ban)小時後(hou)照相，觀察膠圖(tu)，根據(ju)膠(jiao)圖(tu)粗略鑒(jian)定插(cha)入片段(duan)的大小及(ji)小片段(duan)率(lv)。
6．將快(kuai)速(su)鑒(jian)定和菌落(luo) PCR 檢測(ce)合格(ge)的文庫(ku)送檢。不(bu)必要(yao)額(e)外(wai)煮沸。只需要(yao)挑取(qu)少許克(ke)隆(long)，在配(pei)好(hao)的 PCR 反應(ying)
液中涮幾(ji)下(xia)，然(ran)後用正常(chang)的 PCR 反應(ying)程序(xu)即可(ke)。因為(wei)在 PCR 第壹個(ge)循環 94°變性的步驟(zhou)中（正(zheng)常設置(zhi)為 4-5min 即
可(ke)），質粒(li)或(huo)基(ji)因組(zu)肯(ken)定(ding)有(you)釋(shi)放(fang)，也(ye)足夠(gou) PCR 反應(ying)的模板用量了(le)，這(zhe)個(ge)我(wo)每(mei)天都(dou)在做，還沒有(you)做(zuo)不(bu)出的時候。
只需(xu)要(yao)挑取(qu)少許克(ke)隆(long)，在配(pei)好(hao)的 PCR 反應(ying)液中涮幾(ji)下(xia)，然(ran)後用正常(chang)的 PCR 反應(ying)程序(xu)即可(ke)。因為(wei)在 PCR 第壹個(ge)
循環 94°C 變性的步驟(zhou)中（正(zheng)常設置(zhi)為 4-5min 即可(ke)），質粒(li)或(huo)基(ji)因組(zu)肯(ken)定(ding)有(you)釋(shi)放(fang)，也(ye)足夠(gou) PCR 反應(ying)的模板用量了(le)，
這個(ge)我(wo)每(mei)天都(dou)在做，還沒有(you)做(zuo)不(bu)出的時候。
補充幾(ji)點(dian)如下：
1. 沾(zhan)有(you)菌(jun)落的牙簽(qian)在 PCR 反應(ying)液中涮過(guo)之後(hou)，還可(ke)以直(zhi)接(jie)扔(reng)到 LB 培養基(ji)中用來(lai)接(jie)種（問題不(bu)大，重(zhong)組質(zhi)粒(li)壹般(ban)都(dou)
含抗性的）。
2. 在做菌落 PCR 的時候，每(mei)次(ci)都(dou)要(yao)做陰(yin)性(xing)、陽性對(dui)照，陽性對(dui)照可(ke)以用抽提(ti)好的質粒(li)或(huo)基(ji)因組(zu)，這樣(yang)可(ke)以確(que)定(ding) PCR
主反應(ying)液的配(pei)制(zhi)沒有(you)問題，不(bu)會因為(wei)菌落(luo) PCR 陰性而(er)懷疑 PCR 的反應(ying)；陰性(xing)對(dui)照加(jia)壹點(dian)水或者(zhe)什麽都(dou)不(bu)加，這樣可(ke)
以幫(bang)助(zhu)識別(bie) PCR 反應(ying)是(shi)否有(you)假陽性產生的可(ke)能；如(ru)果(guo)偷懶的話，陰(yin)性(xing)對(dui)照可(ke)以不(bu)做，但陽性對(dui)照則是(shi)必須要(yao)做的。
3. 再(zai)告(gao)訴(su)大家(jia)壹個(ge)偷懶的菌落(luo) PCR 鑒(jian)定的方(fang)法：按照每(mei)次(ci)反應(ying) 15-20 ul 的體系(xi)計(ji)算(suan)好(hao) PCR 各(ge)反應(ying)組分(fen)的量/次(ci)，
然(ran)後壹次(ci)性配(pei)制(zhi) 100 次(ci)或 50 次(ci)反應(ying)的量，做(zuo)成(cheng) Ready-to-use 的 PCR 主反應(ying)液（除(chu) Primers、Taq 酶不(bu)加，模板
用的是(shi)菌落(luo)），每(mei)次(ci)做菌(jun)落 PCR 的時候，只需(xu)要(yao)根據(ju)反應(ying)的個(ge)數(shu)，吸(xi)取(qu)相應(ying)的 PCR 主反應(ying)液，補加(jia)相應(ying)的 Primers、
Taq 酶，再(zai)分(fen)裝(zhuang)即(ji)可(ke)。這樣(yang)的好處有(you)二：即開(kai)即(ji)用，節省(sheng)時間(jian)；另(ling)外(wai)反應(ying)組分(fen)均壹，可(ke)減少(shao)實(shi)驗批次(ci)之間(jian)的誤差(cha)。
用槍頭挑取(qu)半(ban)個(ge)菌落，加(jia)入 MIX(除了(le)模板其(qi)他(ta)的都(dou)有(you)），平(ping)板(ban)放(fang)入培養箱繼續(xu)培養。等(deng) PCR 結(jie)果(guo)出來(lai)了(le)，直(zhi)接(jie)
挑取(qu)陽性克(ke)隆(long)搖菌。
還可(ke)以采(cai)用菌落(luo)裂解電(dian)泳(yong)的方(fang)法直(zhi)接(jie)挑取(qu)重(zhong)組子(zi)。壹般(ban)目(mu)的片段(duan)如果不(bu)是(shi)很小(xiao)，空(kong)載體和重(zhong)組載(zai)體比較(jiao)容(rong)易(yi)區分(fen)的
話，都(dou)可(ke)以采(cai)用這種方(fang)法。 將(jiang)菌落(luo)培養時間稍(shao)微(wei)延長，挑取(qu)半(ban)個(ge)菌落加(jia)入裂解液(ye)中，同(tong)時(shi)挑取(qu)藍(lan)斑(ban)（如(ru)非蘭(lan)白斑(ban)，
直(zhi)接(jie)取(qu)空(kong)載體質(zhi)粒(li)）作(zuo)為(wei)對(dui)照，電(dian)泳(yong)即(ji)可(ke)區分(fen)。 這(zhe)個(ge)方(fang)法有(you)現(xian)成的試劑(ji)盒(he)，也可(ke)以自(zi)己配(pei)制(zhi)。
菌(jun)落(luo) PCR：我(wo)的做法是(shi)用槍頭挑菌(jun)落，在分(fen)裝(zhuang)好(hao)的 pcr 反應(ying)體系(xi)（除(chu)了(le) Taq 酶(mei)）中吸(xi)幾(ji)下(xia)，然(ran)後在 100 度 5 分(fen)鐘裂(lie)
解後(hou)加(jia)入 Taq 酶，然(ran)後就(jiu)可(ke)以進行(xing) pcr 循(xun)環了(le)。
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