熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR（qPCR）實(shi)驗技巧：提高(gao) PCR 特異性的 9 種方法

實(shi)時熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR（qPCR）是(shi)生(sheng)命(ming)科學(xue)領域(yu)的(de)革命(ming)性技術，能在(zai) PCR 擴(kuo)增過程(cheng)中(zhong)實(shi)時監(jian)測(ce)熒(ying)光(guang)信號(hao)，實(shi)現對靶(ba)基(ji)因的(de)精確定量。熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR 已(yi)成為(wei)分(fen)子生(sheng)物學(xue)領域(yu)的(de)金(jin)標(biao)準(zhun)技術，但(dan)其(qi)特異性優化仍是許多研(yan)究(jiu)者面臨(lin)的(de)挑(tiao)戰(zhan)。

然而，PCR 特異性問(wen)題始終困(kun)擾(rao)著許多研(yan)究(jiu)人(ren)員(yuan)。非(fei)特異性擴增不(bu)僅會(hui)導致(zhi)實(shi)驗結果不準(zhun)確，還會浪費(fei)寶(bao)貴(gui)的(de)樣(yang)本(ben)和(he)時間(jian)。本(ben)文將(jiang)詳細(xi)介紹提高(gao) PCR 特異性的九大(da)方(fang)法，並(bing)結合(he)最新市場數據(ju)，幫助您選(xuan)擇(ze)適(shi)合(he)的(de)熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR 儀(yi)器和(he)試(shi)劑(ji)。

壹、引物設計(ji)：特異性擴增的(de)基(ji)石

細(xi)心(xin)地進行(xing)引物設計(ji)是 PCR 中(zhong)最重(zhong)要的壹步。理(li)想的引物對只(zhi)同(tong)目的序列(lie)兩側(ce)的(de)單(dan)壹(yi)序列(lie)而非其(qi)他(ta)序列(lie)退(tui)火。設(she)計(ji)糟糕的(de)引物可能會(hui)同(tong)擴(kuo)增其(qi)他(ta)的非(fei)目的序列(lie)。

引物設計(ji)的關(guan)鍵(jian)原則(ze)

• 長度適宜(yi)：典(dian)型(xing)的引物 18 到(dao) 24 個(ge)核苷長。引物需要足夠長，保證(zheng)序列(lie)特性，但(dan)大(da)於(yu) 24 核苷的引物並不意(yi)味著更(geng)高的(de)特異性。

• GC 含(han)量合(he)理(li)：選(xuan)擇(ze) GC 含(han)量為(wei) 40％到(dao) 60％或(huo) GC 含(han)量映(ying)像模板 GC 含(han)量的(de)引物。設計(ji) 5' 端和(he)中(zhong)間(jian)區(qu)為(wei) G 或(huo) C 的(de)引物，增加(jia)引物穩定性。

• 避免(mian)二聚(ju)體：避免(mian)引物對 3' 末(mo)端存(cun)在(zai)互(hu)補(bu)序(xu)列(lie)，這會形(xing)成引物二聚體，抑制(zhi)擴增。

• 3' 末(mo)端設(she)計(ji)：避免(mian) 3' 末(mo)端富(fu)含(han) GC，保證(zheng)在(zai)最後(hou) 5 個(ge)核苷中(zhong)含(han)有(you) 3 個(ge) A 或(huo) T。避免(mian) 3' 末(mo)端的(de)錯誤(wu)配對。

• 二(er)級(ji)結構(gou)：避免(mian)存(cun)在(zai)可(ke)能(neng)會產生(sheng)內部(bu)二(er)級(ji)結構(gou)的(de)序列(lie)，這會破壞引物退(tui)火穩(wen)定(ding)性。

使用(yong) NCBI Primer-BLAST 工(gong)具進(jin)行(xing)引物設計(ji)，註意(yi)跨(kua)外顯子連接(jie)區設(she)計(ji)，避免(mian)基(ji)因組 DNA 擴(kuo)增。

二(er)、引物退(tui)火溫(wen)度(du)：精確控制(zhi)的關(guan)鍵(jian)

熔解(jie)溫(wen)度(du)（Tm）是(shi)當(dang) 50％的(de)引物和(he)互(hu)補(bu)序(xu)列(lie)表現(xian)為(wei)雙鏈(lian) DNA 分(fen)子時的(de)溫(wen)度(du)。Tm 對於(yu)設(she)定 PCR 退(tui)火溫(wen)度(du)是(shi)必需(xu)的(de)。

優化策(ce)略(lve)

• 合理(li)的退(tui)火溫(wen)度(du)從(cong) 55℃到(dao) 70℃，壹般(ban)設(she)定(ding)比引物的 Tm 低 5℃。

• 為(wei)獲得最佳結果，兩個(ge)引物應具有(you)近(jin)似(si)的 Tm 值(zhi)（差(cha)異不超過 5℃）。

• 可以(yi)通(tong)過分(fen)析(xi)幾(ji)個(ge)逐(zhu)步提高(gao)退(tui)火溫(wen)度(du)的(de)反(fan)應以提高(gao)特異性，以 2℃為(wei)增量逐(zhu)步提高(gao)退(tui)火溫(wen)度(du)。

三(san)、遞減 PCR：逐(zhu)步提高(gao)特異性的方法

遞減 PCR 通(tong)過在(zai) PCR 的(de)前(qian)幾個(ge)循(xun)環(huan)使(shi)用(yong)嚴(yan)緊的退(tui)火條(tiao)件提高(gao)特異性。循(xun)環(huan)開始在(zai)比(bi)估(gu)算(suan)的(de) Tm 高(gao)大(da)約 5℃的(de)退(tui)火溫(wen)度(du)下(xia)開始，然後(hou)每(mei)個(ge)循(xun)環(huan)降低 1℃到(dao) 2℃，直到(dao)退(tui)火溫(wen)度(du)低於 Tm 5℃。

這種方法只(zhi)有同(tong)源性最高的目的模板會(hui)被(bei)擴增，這些產(chan)物在(zai)隨(sui)後(hou)的循(xun)環(huan)中(zhong)繼(ji)續擴(kuo)增，並(bing)會(hui)將(jiang)擴(kuo)增的(de)非(fei)特異性產物排(pai)擠出(chu)去。

四(si)、引物濃度：平(ping)衡(heng)產量與(yu)特異性

引物的濃度(du)會影(ying)響特異性。最佳的引物濃度壹(yi)般(ban)在(zai) 0.1 到(dao) 0.5μM。較高(gao)的(de)引物濃度會(hui)導致(zhi)非特異性產物擴增。

可(ke)以(yi)使(shi)用(yong)光(guang)吸(xi)收值(zhi)和(he)微摩消(xiao)光(guang)系數(shu)的倒(dao)數（nmol/OD），通(tong)過 Beers 法則(ze)計(ji)算(suan)引物濃度。避免(mian)使用(yong)寡(gua)聚(ju)核苷酸作(zuo)為(wei)標(biao)準(zhun)在(zai) EB 染(ran)色的(de)膠(jiao)上估(gu)算(suan)引物濃度，因(yin)為(wei)引物和(he)標(biao)準(zhun)的(de)染色能(neng)力(li)根(gen)據(ju)序(xu)列(lie)不同(tong)而差異很大(da)。

五(wu)、引物純度和(he)穩(wen)定(ding)性：保證(zheng)實(shi)驗結果的壹(yi)致(zhi)性

定制(zhi)引物的標(biao)準(zhun)純(chun)度對於(yu)大(da)多數(shu) PCR 應用(yong)是足(zu)夠的。但(dan)部(bu)分(fen)應用(yong)需要純化，以(yi)除(chu)去在(zai)合(he)成過程(cheng)中(zhong)的任(ren)何(he)非全(quan)長序列(lie)。

引物保存(cun)建(jian)議

• 最好在(zai) TE 重(zhong)溶(rong)引物，使其(qi)最終濃度(du)為(wei) 100μM。

• 將(jiang)幹粉(fen)和(he)溶(rong)解(jie)的(de)引物儲存(cun)在(zai) - 20℃。

• 大(da)於(yu) 10μM 濃度溶(rong)於 TE 的(de)引物在(zai) - 20℃可(ke)以(yi)穩定保存(cun) 6 個(ge)月(yue)。

• 幹粉(fen)引物可以在(zai) - 20℃保存(cun)至少(shao) 1 年(nian)。

六、熱(re)啟動(dong) PCR：有效(xiao)防止非特異性擴增

熱(re)啟動(dong) PCR 是除了(le)好的(de)引物設計(ji)之外，提高(gao) PCR 特異性最重(zhong)要的方法之(zhi)壹(yi)。盡(jin)管 Taq DNA 聚(ju)合(he)酶的最佳延伸(shen)溫(wen)度(du)在(zai) 72℃，聚(ju)合(he)酶在(zai)室(shi)溫(wen)仍然有(you)活性，因此(ci)在(zai)進(jin)行(xing) PCR 反應配制(zhi)過程(cheng)中(zhong)會產(chan)生(sheng)非特異性的產物。

Platinum Taq DNA 聚合酶對於(yu)自動熱(re)啟動(dong) PCR 來說(shuo)方(fang)便(bian)高(gao)效(xiao)。同(tong)經(jing)化(hua)學(xue)修(xiu)飾(shi)用(yong)於熱(re)啟動(dong)的 Taq DNA 聚合酶相比，Platinum 酶不需要在(zai) 94℃延時保溫(wen)（10 到(dao) 15 分(fen)鐘(zhong)）以激活聚(ju)合酶。

七、鎂(mei)離(li)子濃(nong)度(du)：影(ying)響 PCR 多個(ge)方(fang)面(mian)

鎂(mei)離(li)子影(ying)響 PCR 的多個(ge)方(fang)面(mian)，如 DNA 聚合酶的活性，這會影(ying)響產量；再(zai)如引物退(tui)火，這會影(ying)響特異性。包含(han) 200μM dNTP 的(de)典型(xing) PCR 起始濃度(du)是(shi) 1.5mM（對實(shi)時定(ding)量 PCR，使(shi)用(yong) 3 到(dao) 5mM 帶有(you)熒(ying)光(guang)探(tan)針(zhen)的(de)鎂(mei)離(li)子溶(rong)液(ye)）。

為(wei)了(le)確定最佳濃度(du)，從(cong) 1mM 到(dao) 3mM，以 0.5mM 遞增，進(jin)行(xing)鎂(mei)離(li)子滴(di)定(ding)。Platinum Taq DNA 聚合(he)酶能夠在(zai)比(bi) Taq DNA 聚(ju)合酶更(geng)廣的(de)鎂(mei)離(li)子濃(nong)度(du)範圍(wei)內(nei)保持功能，因(yin)此(ci)僅需(xu)較少(shao)的(de)優化。

八(ba)、PCR 添加(jia)劑(ji)：增強(qiang)困(kun)難(nan)模板的(de)擴(kuo)增

對於(yu)高(gao) GC 含(han)量的(de)模板等困難模板，需(xu)要添加(jia)輔(fu)助(zhu)物質。PCR 添加(jia)劑(ji)包(bao)括(kuo)甲酰胺(an)、DMSO、甘(gan)油(you)、甜(tian)菜(cai)堿(jian)以(yi)及(ji) PCRx Enhancer Solution 可以(yi)增強(qiang)擴(kuo)增。

它(ta)們可(ke)能(neng)的(de)機理是(shi)降低熔解(jie)溫(wen)度(du)，從(cong)而有助(zhu)於(yu)引物退(tui)火並(bing)輔(fu)助(zhu) DNA 聚(ju)合(he)酶延伸(shen)通(tong)過二級(ji)結構(gou)區(qu)。為(wei)獲得最佳結果，應優化添(tian)加(jia)劑(ji)的(de)濃(nong)度，尤(you)其(qi)是(shi)會抑制(zhi) Taq DNA 聚合酶的 DMSO、甲酰胺(an)和(he)甘(gan)油(you)。

九、巢式 PCR：大(da)幅(fu)提高(gao)特異性和(he)靈(ling)敏度

使用(yong)巢式引物進行(xing)連續(xu)多輪(lun)擴增可(ke)以(yi)顯(xian)著(zhu)提高(gao)特異性和(he)靈(ling)敏度。第壹輪(lun)是 15 到(dao) 20 個(ge)循(xun)環(huan)的(de)標(biao)準(zhun)擴(kuo)增，將(jiang)壹(yi)小(xiao)部(bu)分(fen)起始擴增產(chan)物稀(xi)釋(shi) 100 到(dao) 1000 倍(bei)加(jia)入到(dao)第二(er)輪(lun)擴增中(zhong)進行(xing) 15 到(dao) 20 個(ge)循(xun)環(huan)。

在(zai)第(di)二(er)輪(lun)擴增中(zhong)使用(yong)壹套巢(chao)式引物，其(qi)可(ke)以同(tong)第(di)壹(yi)套引物內側的(de)靶(ba)序列(lie)結合(he)。巢式 PCR 的(de)使(shi)用(yong)降低了(le)擴增多個(ge)靶(ba)位點的可(ke)能性，因為(wei)同(tong)兩套引物都互(hu)補(bu)的(de)靶(ba)序列(lie)很少(shao)。

熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR 儀(yi)器選(xuan)擇(ze)指(zhi)南(nan)

實(shi)驗質量控制(zhi)要點

為(wei)確保 qPCR 實(shi)驗結果可靠(kao)性，必須(xu)設(she)置以下(xia)五(wu)種必要對照(zhao)：

• NTC（無(wu)模板對照(zhao)）：監(jian)測(ce)引物二聚體 / 體系汙(wu)染。

• NRT（無(wu)逆(ni)轉錄對照(zhao)）：檢測(ce) gDNA 殘留(liu)。

• 陽性對照(zhao)：確認反應體系有(you)效(xiao)性。

• 標(biao)準(zhun)曲(qu)線：計(ji)算(suan)引物擴增效(xiao)率(lv)。

• 內參(can)對照(zhao)：樣(yang)本(ben)間(jian)歸(gui)壹化(hua)基(ji)準(zhun)。

提高(gao) PCR 特異性需要綜(zong)合(he)考(kao)慮引物設計(ji)、反應條(tiao)件優化和(he)添(tian)加(jia)劑(ji)使(shi)用(yong)等多個(ge)方(fang)面(mian)。通(tong)過本(ben)文介紹的九種方法，您可以(yi)顯著提高(gao) PCR 反(fan)應的特異性，獲得更(geng)加(jia)可(ke)靠(kao)實(shi)驗結果。

同(tong)時，選(xuan)擇(ze)高(gao)質量的(de) PCR 儀(yi)器和(he)試(shi)劑(ji)也是確保實(shi)驗結果重(zhong)復性的重(zhong)要因素。根(gen)據(ju)您的實(shi)驗需(xu)求和(he)預(yu)算(suan)，選(xuan)擇(ze)適(shi)合(he)的(de)熒(ying)光(guang)定(ding)量 PCR 儀(yi)，將(jiang)有(you)助(zhu)於您獲得更(geng)加(jia)準(zhun)確和(he)可(ke)靠(kao)的(de)實(shi)驗結果。