不同(tong)類型(xing)內(nei)切酶(mei)的切割機(ji)制(zhi)有哪些(xie)差異？

內切酶(mei)是(shi)壹類能(neng)夠(gou)識(shi)別並(bing)切割特定(ding)脫氧核苷(gan)酸序列的酶(mei)，不同(tong)類型(xing)的內(nei)切酶(mei)在(zai)切割機(ji)制(zhi)上(shang)存在(zai)差異。以(yi)下將(jiang)詳(xiang)細介紹(shao)不同(tong)類型(xing)內(nei)切酶(mei)的切割機(ji)制(zhi)差異。

壹(yi)、限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)

限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)主(zhu)要(yao)分為三種(zhong)類型(xing)：Type Ⅰ、Type Ⅱ 及(ji) Type Ⅲ。

Type Ⅰ 限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)：既(ji)能(neng)催(cui)化宿主(zhu) DNA 的甲基化，又催(cui)化非(fei)甲基化的 DNA 的水(shui)解(jie)。其(qi)切割機(ji)制(zhi)較(jiao)為復雜(za)，通常需要(yao)多(duo)個(ge)亞基協同(tong)作用，識別特定(ding)的 DNA 序列後，在(zai)遠離(li)識別位(wei)點(dian)的地(di)方進行切割。

Type Ⅱ 限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)：只催(cui)化非(fei)甲基化的 DNA 的水(shui)解(jie)。Type Ⅱ 限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)所(suo)識(shi)別的位(wei)置(zhi)多(duo)為短的回(hui)文(wen)序列，所(suo)剪(jian)切的堿(jian)基序列通常即(ji)為所(suo)識(shi)別的序列。這類內切酶(mei)在(zai)基因工程(cheng)上(shang)實用性較(jiao)高(gao)，如(ru) EcoRⅠ、HindⅢ 等(deng)。其(qi)切割機(ji)制(zhi)相對簡(jian)單(dan)，通常由單壹的蛋(dan)白質(zhi)亞基組成(cheng)，識(shi)別特定(ding)的 DNA 序列後，在(zai)識(shi)別位(wei)點(dian)處(chu)進行切割。

Type Ⅲ 限(xian)制(zhi)性內切酶(mei)：同(tong)時(shi)具(ju)有修(xiu)飾(shi)及(ji)認知(zhi)切割的作用。其(qi)切割機(ji)制(zhi)與(yu) Type Ⅰ 和(he) Type Ⅱ 有所(suo)不同(tong)，通常需要(yao)多(duo)個(ge)亞基協同(tong)作用，識別特定(ding)的 DNA 序列後，在(zai)識(shi)別位(wei)點(dian)下(xia)遊壹定(ding)距(ju)離(li)處進行切割。

二(er)、歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)

LAGLIDADG 歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)：是(shi)可用於(yu)基因組編(bian)輯應用的位(wei)點(dian)特異性移動核酸(suan)內切酶(mei)。其(qi)切割機(ji)制(zhi)涉(she)及(ji)對 DNA 形狀(zhuang)和(he)柔(rou)韌(ren)性的間(jian)接讀(du)出(chu)，特別是(shi)在發(fa)生(sheng)切割的中(zhong)心 4 個(ge)堿(jian)基處。通過功能(neng)選(xuan)擇和(he)深度(du)測序分(fen)析(xi)發(fa)現，野(ye)生型(xing)活性位點(dian)並(bing)非(fei)對所(suo)有底物(wu)都是(shi)最(zui)佳的，新的活性位點(dian)殘(can)基組合(he)可以(yi)支持在野(ye)生型(xing)酶(mei)難(nan)以(yi)裂(lie)解(jie)的底(di)物(wu)上(shang)的活性。例如(ru)，兩(liang)個(ge)金屬結(jie)合(he)殘(can)基中(zhong) E 或(huo) D 取(qu)代(dai)的組合(he)極(ji)大(da)地(di)影(ying)響(xiang)了(le)切割活性，而 E184D 變體(ti)具有更寬的切割特性。對 I-LtrI E184D 和(he)與(yu)非(fei)同(tong)源(yuan) AACC 中(zhong)樞 4 序列共結晶(jing)的野(ye)生型(xing)蛋(dan)白質(zhi)的分(fen)析(xi)顯(xian)示，結(jie)構(gou)差異與(yu)切割單個(ge) DNA 鏈的動力學常(chang)數(shu)相關(guan)。

其(qi)他(ta)歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)：許(xu)多(duo)微生物(wu)的基因組中(zhong)含有編(bian)碼(ma)罕(han)見(jian)切割歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)的遺(yi)傳(chuan)元件，這些(xie)內切酶(mei)有助於(yu)編(bian)碼(ma)它們(men)的元(yuan)件（如(ru)自剪(jian)接的 I 組和(he) II 組內(nei)含子(zi)以(yi)及在(zai)某(mou)些(xie)情況(kuang)下(xia)的內(nei)含(han)肽(tai)）的移(yi)動。歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)有幾個(ge)不同(tong)的家族(zu)，它們啟(qi)動和(he)靶向特定(ding)序列進行橫向轉(zhuan)移(yi)的能(neng)力使其(qi)成(cheng)為有吸引(yin)力的基因靶向試(shi)劑。歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)已被(bei)應用於(yu)促(cu)進 DNA 修(xiu)飾(shi)或(huo)基因組編(bian)輯，如(ru)基因修(xiu)復或(huo) “基因敲除(chu)"。對歸巢(chao)內切核酸(suan)酶(mei)的工(gong)程(cheng)改(gai)造策(ce)略也(ye)在不斷(duan)發(fa)展，以(yi)改(gai)變其(qi)靶(ba)位點(dian)特異性。

三、限(xian)制(zhi)性核酸(suan)內切酶(mei) CglI

   來(lai)自谷氨(an)酸棒(bang)狀(zhuang)桿(gan)菌(jun)的限(xian)制(zhi)性核酸(suan)內切酶(mei) CglI 識(shi)別不對稱(cheng)的 5'-GCCGC-3' 位(wei)點(dian)，並(bing)在(zai)依賴(lai)於(yu) NTP 水(shui)解(jie)的反(fan)應中(zhong)切割頂部(bu)和(he)底部(bu) DNA 鏈下遊的 DNA 7 和(he) 6/7 核苷(gan)酸。CglI 由兩種(zhong)不同(tong)的蛋(dan)白質(zhi)組成(cheng)：核酸(suan)內切酶(mei)（R.CglI）和(he) DEAD 家族(zu)的解(jie)旋(xuan)酶(mei)樣 ATPase（H.CglI）。這些(xie)亞基與(yu)化(hua)學(xue)計量(liang)比(bi)為 R2H2 形成(cheng)異四(si)聚體(ti)復合(he)物(wu)。然(ran)而，R2H2・CglI 復合(he)物(wu)僅(jin)具(ju)有壹個(ge)足(zu)以(yi)切割壹條 DNA 鏈的核酸(suan)酶(mei)活性位點(dian)，這表明(ming)引(yin)入雙鏈斷(duan)裂(lie)需要(yao)兩個(ge)復(fu)合(he)物(wu)。CglI 不需要(yao)在同(tong)壹(yi) DNA 上(shang)的兩(liang)個(ge)位(wei)點(dian)即(ji)可獲(huo)得(de)最(zui)佳催(cui)化活性，但單(dan)點(dian)線(xian)性 DNA 的底(di)物(wu)較(jiao)差，支(zhi)持了(le)壹(yi)種(zhong)機(ji)制(zhi)，其(qi)中(zhong) CglI 復合(he)物(wu)必(bi)須在(zai)激活切割之(zhi)前(qian)沿(yan)壹(yi)維(wei) DNA 輪(lun)廓連(lian)通。CglI 水(shui)解(jie)三(san)磷(lin)酸(suan)腺苷（ATP）會優先(xian)在 DNA 上(shang)從靶(ba)標(biao)的下(xia)遊方向產(chan)生易位，盡(jin)管(guan)上(shang)遊易位也(ye)是可能(neng)的。這種(zhong)作用機(ji)制(zhi)與(yu)其(qi)他(ta) ATP 依賴(lai)性限(xian)制(zhi)性修(xiu)飾(shi)酶(mei)不同(tong)。

四(si)、HigB 毒(du)素切割核酸(suan)內切酶(mei)

   HigB 毒(du)素是壹種(zhong)與(yu)核糖(tang)體(ti)結合(he)的核糖(tang)體(ti)依賴(lai)性毒(du)素，其(qi)切割核酸(suan)內切酶(mei)的機(ji)制(zhi)如(ru)下(xia)：解(jie)決(jue)了(le)綁定(ding)到核糖(tang)體(ti)的野(ye)生型(xing)，核糖(tang)體(ti)依賴(lai)性毒(du)素 HigB 的 X 射(she)線(xian)晶(jing)體(ti)結構(gou)，揭示了(le) mRNA 底(di)物(wu)附近的潛在(zai)催(cui)化殘(can)基。使用基於(yu)細(xi)胞(bao)和(he)生化(hua)分析(xi)，確定(ding) HigB 殘(can)基 His54，Asp90，Tyr91 和(he) His92 對於(yu)體(ti)內活性較(jiao)重(zhong)要(yao)，而 HigB H54A 和(he) Y91A 變體(ti)對體(ti)外 mRNA 切割的影(ying)響(xiang)大(da)。比(bi)較(jiao)具(ju)有 70S-HigB 結合(he)結(jie)構(gou)的兩(liang)個(ge)催(cui)化惰(duo)性 HigB 變體(ti)的 X 射(she)線(xian)晶(jing)體(ti)結構(gou)，發(fa)現(xian) HigB 活性位點(dian)殘(can)基可能(neng)經歷(li)構(gou)象(xiang)重排(pai)，可能(neng)需要(yao)識別其(qi) mRNA 底(di)物。

  當(dang)關(guan)稅(shui)壁(bi)壘(lei)豎起，國產(chan)酶(mei)正(zheng)以(yi)技術(shu)突圍重塑行(xing)業格(ge)局(ju)。蘇州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物(wu)-愚(yu)公(gong)生(sheng)物的Lightning不僅是(shi)科研工具，更是中(zhong)國生物產(chan)業自主(zhu)可控(kong)的戰(zhan)略(lve)支撐(cheng)。選擇(ze)國產(chan)酶(mei)，不僅是(shi)成(cheng)本考量，更是對中(zhong)國智造的信(xin)心投(tou)票！