在 CRISPR-Cas9 基因編(bian)輯技術(shu)中(zhong)常(chang)用的(de)分子(zi)生(sheng)物(wu)學試劑有哪(na)些?

在 CRISPR-Cas9 基因編(bian)輯技術(shu)中(zhong)，常(chang)用的(de)分子(zi)生(sheng)物(wu)學試劑按實(shi)驗(yan)流(liu)程可分(fen)為(wei)載體(ti)構建、gRNA 制(zhi)備(bei)、細胞遞(di)送(song)、編輯檢(jian)測、篩選(xuan)與(yu)修(xiu)復(fu)五(wu)大核(he)心(xin)環節，以下是常(chang)用到(dao)的(de)生(sheng)物(wu)試劑：

壹、載體(ti)構建階(jie)段(duan)

1. 限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)

作(zuo)用：切割(ge)質(zhi)粒(li)載(zai)體(ti)和(he)目(mu)的(de) DNA 片(pian)段(duan)，用於 gRNA 表(biao)達(da)盒(he)或 Cas9 表(biao)達(da)載(zai)體(ti)的(de)組(zu)裝。

常(chang)用酶(mei)：

BsaI：識別非(fei)常(chang)規(gui)回文序(xu)列(lie)（如 GGTCTC），切(qie)割(ge)後產(chan)生(sheng)黏性(xing)末(mo)端，適用於 Golden Gate 克(ke)隆法(fa)，批量組(zu)裝 gRNA 表達(da)單(dan)元(yuan)（尤其適用於 CRISPR 文庫(ku)構建(jian)）。

EcoRI、HindIII：傳(chuan)統(tong)限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)，比(bi)如百(bai)時(shi)美的(de)EG15536S常(chang)用於質(zhi)粒(li)線性(xing)化(hua)（如 pUC19、pSpCas9 載(zai)體(ti)）。

AgeI、AscI：稀有切(qie)點酶(mei)，減(jian)少載體(ti)內(nei)部(bu)酶(mei)切(qie)位(wei)點幹擾，提(ti)高(gao)克(ke)隆效(xiao)率。

應用場景：載(zai)體(ti)酶(mei)切(qie)→目(mu)的(de)片(pian)段(duan)插入→連接(jie)反應（需(xu)配(pei)合 T4 DNA 連接(jie)酶(mei)）。

2. DNA 連接(jie)酶(mei)

T4 DNA 連接(jie)酶(mei)：連接(jie)酶(mei)切(qie)後的(de)載體(ti)與 gRNA 片(pian)段(duan)，形成重(zhong)組(zu)質(zhi)粒。

Gibson 組(zu)裝試劑盒(he)：基於同源(yuan)重組(zu)的(de)無縫(feng)克(ke)隆技術(shu)，無(wu)需(xu)酶(mei)切(qie)位(wei)點，直(zhi)接(jie)拼(pin)接(jie)多個 DNA 片(pian)段(duan)（如 Cas9 表(biao)達(da)盒(he)與 gRNA 陣(zhen)列(lie)）。

3. 質粒(li)提取與純(chun)化試劑

質粒(li)小提試劑盒(he)（如 Qiagen Miniprep）：從(cong)大腸(chang)桿(gan)菌中(zhong)提取重組(zu)質(zhi)粒，用於後續轉染(ran)或測序驗(yan)證(zheng)。

二(er)、gRNA 設(she)計(ji)與制(zhi)備(bei)

1. gRNA 寡(gua)核(he)苷(gan)酸合(he)成

DNA 寡(gua)核苷(gan)酸：合(he)成 gRNA 的(de) crRNA（靶向(xiang)序列(lie)）和(he) tracrRNA 互補鏈，通(tong)常(chang)含(han) 20nt 靶向(xiang)序列(lie) + PAM 鄰(lin)近(jin)序(xu)列(lie)（如 NGG）。

磷酸(suan)化(hua)試劑：如 T4 多核苷(gan)酸激(ji)酶(mei)（PNK），對(dui)寡(gua)核苷(gan)酸 5' 端磷酸(suan)化(hua)，提高(gao)連接(jie)效(xiao)率。

2. 體(ti)外(wai)轉錄（IVT）試劑

RNA 聚(ju)合(he)酶(mei)：如 T7 RNA 聚(ju)合(he)酶(mei)，以(yi) DNA 為(wei)模板轉錄 gRNA（需(xu)含(han) T7 啟動子(zi)序列(lie)），適用於體(ti)外(wai)合成 sgRNA（單(dan)鏈 gRNA）。

RNA 純(chun)化試劑盒(he)（如 RNA Clean & Concentrator）：去除轉錄產(chan)物中(zhong)的(de) DNA 模板和(he)雜質，獲(huo)得高(gao)純(chun)度 sgRNA。

3. 引物(wu)與(yu) PCR 試劑

PCR 引物(wu)：擴增(zeng) gRNA 表達盒(he)（如 U6 啟(qi)動子(zi) + gRNA 序列(lie)），或用於載(zai)體(ti)構建中(zhong)的(de)序列(lie)驗(yan)證(zheng)（如菌(jun)落(luo) PCR）。

高(gao)保真 DNA 聚(ju)合(he)酶(mei)（如 Q5、KOD）：確(que)保擴增(zeng)序列(lie)無突(tu)變，尤其在構建(jian) CRISPR 文庫(ku)時(shi)避(bi)免(mian)靶(ba)向(xiang)誤(wu)差(cha)。

三(san)、細胞遞(di)送(song)與編輯

1. 轉染(ran)試劑

脂質體(ti)轉染(ran)試劑：如 Lipofectamine 3000、JetPrime，將(jiang)重(zhong)組(zu)質(zhi)粒或 sgRNA/Cas9 核(he)糖(tang)核蛋白（RNP）復(fu)合物(wu)導(dao)入細胞（適(shi)用於貼壁細胞，如 HEK293T、HeLa）。

電(dian)轉染(ran)試劑盒(he)：如 Nucleofector 電(dian)轉儀配(pei)套(tao)試劑，適用於難(nan)轉染(ran)細胞（原(yuan)代細胞、免(mian)疫(yi)細胞）。

病(bing)毒(du)包裝試劑：

慢病(bing)毒(du)包裝質粒(li)（psPAX2、pMD2.G）：包裝 Cas9/gRNA 載體(ti)，感(gan)染(ran)分裂(lie)或非(fei)分(fen)裂(lie)細胞（如神經元(yuan)）。

AAV 載(zai)體(ti)系統：含(han) AAV 反向(xiang)末端重復(fu)序列(lie)（ITR）、Cas9 基因，用於體(ti)內(nei)遞(di)送(song)（需(xu)輔(fu)助質(zhi)粒 pAAV-RC、pAAV Helper）。

2. Cas9 蛋白與 RNP 復(fu)合物(wu)

重(zhong)組(zu) Cas9 蛋白：如 SpCas9-NLS（核(he)定(ding)位(wei)信(xin)號(hao)修(xiu)飾(shi)），與 sgRNA 體(ti)外(wai)組(zu)裝成 RNP，瞬(shun)時(shi)轉染(ran)細胞以(yi)降(jiang)低脫靶(ba)風險(xian)（避(bi)免(mian)質(zhi)粒(li)整(zheng)合）。

蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑：如 PMSF，在(zai)蛋白純(chun)化過程中(zhong)保護 Cas9 不被(bei)降(jiang)解。

四(si)、編輯效(xiao)率檢(jian)測

1. PCR 與測序試劑

Taq PCR 試劑盒(he)：擴增(zeng)編輯位點上(shang)下遊 DNA，用於 Sanger 測序（檢(jian)測 Indels）或 TA 克(ke)隆後測序（分(fen)析突變頻(pin)率(lv)）。

高(gao)通(tong)量(liang)測序建(jian)庫(ku)試劑：如 Illumina TruSeq DNA Kit，對(dui)大量(liang)樣(yang)本(ben)進(jin)行深度測序，定(ding)量(liang)脫(tuo)靶效(xiao)應。

2. 錯配(pei)切(qie)割(ge)酶(mei)

T7E1 核(he)酸(suan)酶(mei)/ Surveyor 核(he)酸(suan)酶(mei)：識別編(bian)輯後 DNA 雙(shuang)鏈錯(cuo)配(pei)位點並(bing)切(qie)割(ge)，通(tong)過凝(ning)膠電(dian)泳檢(jian)測突變(bian)效(xiao)率（適(shi)用於初(chu)步(bu)篩選）。

3. 熒光定(ding)量(liang)試劑

qPCR 試劑盒(he)：檢(jian)測報(bao)告基因（如 GFP）的(de)表達(da)變化(hua)，評估基因敲除 / 激活效(xiao)率（需(xu)構(gou)建熒光報(bao)告載體(ti)，如 Cas9-dCas9 融合激活系(xi)統(tong)）。

五(wu)、篩選(xuan)與修復(fu)過程

1. 篩選(xuan)標(biao)記試劑

抗生(sheng)素(su)：如嘌(piao)呤(ling)黴素（Puro）、G418（Neomycin），篩選穩定(ding)整(zheng)合(he) Cas9/gRNA 載體(ti)的(de)細胞克(ke)隆（需(xu)載(zai)體(ti)攜(xie)帶抗(kang)性(xing)基因）。

流(liu)式(shi)細胞儀（FACS）：分(fen)選(xuan)表(biao)達熒光標(biao)記(ji)（如 mCherry）的(de)陽性(xing)細胞，適(shi)用於無(wu)抗(kang)生(sheng)素(su)篩選的(de)場景。

2. HDR 供(gong)體(ti)模板

單(dan)鏈寡(gua)核(he)苷(gan)酸（ssODN）：含(han)同源(yuan)臂的(de)修復(fu)模板，用於精確基因敲入（如點(dian)突(tu)變修(xiu)復(fu)），需(xu)化(hua)學合成並(bing)經(jing) PAGE 純(chun)化。

雙(shuang)鏈 DNA 質(zhi)粒(li)：作(zuo)為(wei) HDR 供體(ti)，攜(xie)帶大片(pian)段(duan)外(wai)源(yuan)基因（如熒光蛋白基因），需(xu)配(pei)合 Cas9 切割(ge)誘(you)導(dao)同源(yuan)重組(zu)。

3. 堿(jian)基編輯相(xiang)關(guan)試劑

脫氨(an)酶(mei)融合蛋白：如胞(bao)嘧(mi)啶(ding)脫(tuo)氨(an)酶(mei)（APOBEC1）或腺(xian)嘌(piao)呤(ling)脫(tuo)氨(an)酶(mei)（TadA），與(yu) Cas9n（切(qie)口酶(mei)）結合(he)，實(shi)現(xian)單(dan)堿(jian)基編輯（如 BE3、ABE 系(xi)統(tong)），無需(xu) DSB 即(ji)可完(wan)成 C→T 或 A→G 替(ti)換。

尿嘧(mi)啶(ding)糖(tang)基化酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑（UGI）：保護編輯過程中(zhong)產(chan)生(sheng)的(de)尿嘧(mi)啶(ding)不(bu)被(bei)修(xiu)復(fu)，提高(gao)堿(jian)基編輯效(xiao)率（常(chang)見於胞嘧啶(ding)堿(jian)基編輯器）。

六、輔助試劑與系(xi)統(tong)優化(hua)

1. 細胞培養(yang)試劑

培養(yang)基與添(tian)加(jia)劑：如 DMEM、胎(tai)牛血清（FBS），維(wei)持(chi)細胞狀(zhuang)態；ROCK 抑(yi)制(zhi)劑（Y-27632）提高(gao)幹(gan)細胞轉染(ran)後的(de)存活率(lv)。

細胞裂(lie)解液：如 RIPA 緩(huan)沖(chong)液，提取細胞蛋白用於 Western blot 檢(jian)測 Cas9 表達(da)。

2. 基因編(bian)輯工具盒(he)

CRISPR 文庫(ku)篩選(xuan)試劑盒(he)：如 Broad Institute 的(de) GeCKO 文庫(ku)，包含(han)靶(ba)向(xiang)全(quan)基因組(zu)的(de) gRNA 陣(zhen)列(lie)，用於功(gong)能(neng)基因篩(shai)選(xuan)（需(xu)配(pei)合慢病毒(du)包(bao)裝試劑）。

CRISPR 激活 / 抑(yi)制(zhi)系(xi)統(tong)：dCas9-VPR（激(ji)活）或 dCas9-KRAB（抑(yi)制(zhi)）質(zhi)粒(li)，搭配(pei) sgRNA 實(shi)現(xian)基因轉錄調控，需(xu)啟(qi)動子(zi)區域(yu)靶(ba)向(xiang) gRNA。

試劑分類與(yu)應用流(liu)程圖

實(shi)驗(yan)流(liu)程                核心(xin)試劑                                  作(zuo)用

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載體(ti)構建              限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)（BsaI、EcoRI）、T4連接(jie)酶(mei)        切(qie)割(ge)/連接(jie)gRNA/Cas9載(zai)體(ti)

gRNA制(zhi)備(bei)             IVT試劑盒(he)（T7聚(ju)合(he)酶(mei)）、DNA寡(gua)核(he)苷(gan)酸           合(he)成sgRNA

細胞遞(di)送(song)            轉染(ran)試劑（脂質體(ti)/電轉）、病毒(du)包(bao)裝質粒(li)           導(dao)入細胞/體(ti)內(nei)遞(di)送(song)

編(bian)輯檢(jian)測            T7E1酶(mei)、PCR試劑、測序試劑盒(he)                  評估突變效(xiao)率與(yu)脫靶(ba)

篩選修復(fu)            抗生(sheng)素(su)、ssODN供體(ti)、堿(jian)基編輯器組(zu)分(fen)            篩選(xuan)陽性(xing)細胞/精確修(xiu)復(fu)

輔助優(you)化            細胞培養(yang)基、CRISPR文庫(ku)、蛋白酶(mei)抑(yi)制(zhi)劑          系統(tong)優(you)化與(yu)功(gong)能(neng)擴展(zhan)

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實驗(yan)試劑選擇(ze)策(ce)略與註意(yi)事項(xiang)：

遞送(song)效(xiao)率：原(yuan)代細胞先(xian)選(xuan)電轉或病(bing)毒(du)載(zai)體(ti)，貼壁細胞可(ke)用脂質體(ti)轉染(ran)。

檢(jian)測精度需(xu)求(qiu)：初步(bu)篩(shai)選(xuan)用 T7E1 酶(mei)，精準(zhun)分(fen)析需(xu)高(gao)通(tong)量(liang)測序。

修(xiu)復(fu)類型(xing)選(xuan)擇：基因敲除依賴(lai) NHEJ（無需(xu)供(gong)體(ti)），精確編(bian)輯需(xu) HDR（需(xu) ssODN/dsDNA 供(gong)體(ti)）。

安全(quan)性(xing)考(kao)量：RNP 復(fu)合物(wu)（蛋白 + sgRNA）可減少質粒(li)整(zheng)合風險(xian)，適(shi)用於醫(yi)學(xue)研究。

蘇(su)州阿爾法(fa)生(sheng)物(wu)作(zuo)為(wei)百(bai)時(shi)美的(de)聯(lian)盟(meng)供(gong)應商(shang)提(ti)供實驗(yan)室(shi)儀器設(she)備(bei)， 實(shi)驗(yan)耗(hao)材，生(sheng)物(wu)試劑的(de)壹站式(shi)服(fu)務，所(suo)提供(gong)的(de)分子(zi)生(sheng)物(wu)學試劑主要包(bao)括：限(xian)制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei) ，taq聚(ju)合(he)酶(mei)，逆轉試劑盒(he)，熒光定(ding)量(liang)試劑、體(ti)外(wai)轉錄酶(mei)等。