限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)星活性(xing)產(chan)生(sheng)的原(yuan)因(yin)？

限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)是分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)中常(chang)用的(de)工具(ju)，它(ta)們(men)在DNA的(de)特(te)定位置進(jin)行(xing)切(qie)割(ge)，這壹過程(cheng)被稱(cheng)為酶切(qie)反(fan)應。然(ran)而，限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)的活性(xing)可能(neng)會(hui)受到(dao)多(duo)種(zhong)因(yin)素的影響(xiang)，其中包(bao)括(kuo)壹種(zhong)被(bei)稱(cheng)為“星號活性(xing)"（star activity ）的(de)現象。

限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)的星號活性(xing)

  星號活性(xing)是(shi)指(zhi)限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)在非優條件(jian)下，切(qie)割(ge)DNA時出現的非特(te)異性(xing)現象。這種(zhong)活性(xing)早(zao)在1975年研究(jiu)限制(zhi)酶(mei) EcoRI時被發現。在特(te)定的條件(jian)下，例如(ru)降(jiang)低反(fan)應緩(huan)沖(chong)液中的(de)離(li)子(zi)強(qiang)度並提高(gao)pH值，EcoRI的識別特(te)異性(xing)會(hui)發生(sheng)變(bian)化(hua)，導致(zhi)其在(zai)非典型位(wei)點進(jin)行(xing)切(qie)割(ge)。

 星號活性(xing)的(de)命名由來

“星號活性(xing)"壹(yi)詞(ci)的(de)由(you)來有(you)兩(liang)種(zhong)解(jie)釋。壹種(zhong)解(jie)釋是，這(zhe)種(zhong)活性(xing)像(xiang)壹(yi)顆(ke)遊蕩(dang)的(de)星星，在典型切(qie)割(ge)位點之外的其他(ta)位置切(qie)割(ge)DNA。另(ling)壹(yi)種(zhong)解(jie)釋是，將(jiang)典型的(de)限制(zhi)酶(mei)識(shi)別序(xu)列比(bi)作(zuo)地圖(tu)上的主(zhu)要路徑，當限制(zhi)酶(mei)處於非優條件(jian)時，會(hui)偏(pian)離(li)主(zhu)路徑，類(lei)似星形(xing)符(fu)號的分(fen)叉(cha)。

星號活性(xing)的(de)特(te)點

 星號活性(xing)並非全隨(sui)機的(de)切(qie)割(ge)，而是壹種(zhong)部(bu)分(fen)非特(te)異性(xing)的(de)切(qie)割(ge)。幾乎所有(you)限制(zhi)酶(mei)在(zai)非優條件(jian)下都(dou)可能(neng)產生(sheng)星號活性(xing)，但(dan)每(mei)種(zhong)酶(mei)產(chan)生(sheng)星號活性(xing)的(de)機(ji)制(zhi)可能(neng)不(bu)同(tong)。

影響(xiang)星號活性(xing)的(de)因(yin)素

1.  pH值：當pH大(da)於8.0時，可能(neng)會(hui)出(chu)現星號活性(xing)。

2.鹽(yan)離(li)子(zi)濃(nong)度：鹽離(li)子(zi)濃(nong)度小於50mmol/L時，星號活性(xing)更易(yi)發生(sheng)。

3.有(you)機溶(rong)劑濃度：例如(ru)甘油(you)濃(nong)度大(da)於5%時，可能(neng)會(hui)影響(xiang)酶(mei)的(de)活性(xing)。

4.替代Mg2+的二價陽離子(zi)：存(cun)在(zai)時可能(neng)會(hui)引(yin)起星號活性(xing)。

5.酶(mei)的(de)用(yong)量(liang)：限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)核(he)酸(suan)酶(mei)用(yong)量大(da)於100u/g DNA時，也可能(neng)導致(zhi)星號活性(xing)。

其他(ta)影響(xiang)限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)活性(xing)的(de)因(yin)素

6.DNA純度：DNA樣(yang)品(pin)中若(ruo)含有(you)蛋(dan)白(bai)質(zhi)或(huo)其他(ta)雜質(zhi)，可能(neng)會(hui)降(jiang)低限制(zhi)酶(mei)的(de)活性(xing)。

7.酶(mei)切(qie)消(xiao)化(hua)反應(ying)的溫(wen)度：不(bu)同(tong)的核(he)酸(suan)內(nei)切(qie)限制(zhi)酶(mei)具(ju)有(you)各自(zi)的適反(fan)應(ying)溫度。

8.DNA的分(fen)子(zi)結(jie)構(gou)：DNA的分(fen)子(zi)構(gou)型對酶的活性(xing)有(you)較大(da)影響(xiang)。

避(bi)免(mian)限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)的星號活性(xing)的(de)策(ce)略(lve)：

1.優化(hua)反應(ying)條件(jian)：

l  pH值：確保(bao)反應(ying)緩(huan)沖(chong)液的(de)pH值在酶的最(zui)適範(fan)圍(wei)內(nei)，通(tong)常(chang)在7.5到(dao) 8.0之間。避(bi)免(mian)使用(yong)過(guo)高(gao)的(de)pH值。

l  鹽離子(zi)濃(nong)度：使用(yong)推薦濃(nong)度的鹽(yan)離子(zi)（通(tong)常(chang)是50-100 mM）來(lai)維(wei)持酶的穩定(ding)性(xing)和(he)特(te)異性(xing)。

l  Mg2+濃(nong)度：確保(bao)Mg2+的濃(nong)度在酶(mei)的最(zui)適範(fan)圍(wei)內(nei)，通(tong)常(chang)為1-10 mM。

l  使用(yong)高(gao)質(zhi)量(liang)的反應試(shi)劑：

l  DNA模板(ban)：使用(yong)高(gao)純(chun)度的DNA模(mo)板(ban)，避(bi)免(mian)汙染(ran)，特(te)別是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)和(he)其他(ta)雜質(zhi)。

2.限制(zhi)酶(mei)：使(shi)用高(gao)質(zhi)量(liang)的酶（比(bi)如(ru)：百時美(mei)生(sheng)物酶(mei)），並確保(bao)按照(zhao)制(zhi)造(zao)商(shang)的指(zhi)南(nan)進(jin)行(xing)儲存(cun)和(he)使(shi)用。

3.控制(zhi)酶(mei)的(de)用量：

l  不(bu)要使(shi)用(yong)過量的酶，按(an)照(zhao)制(zhi)造(zao)商(shang)的建議(yi)或(huo)實驗(yan)需求(qiu)來確定最(zui)佳(jia)用(yong)量(liang)。

l  避(bi)免(mian)有(you)機溶(rong)劑：

l  減少(shao)反應混(hun)合物(wu)中有(you)機溶(rong)劑（如(ru)甘油(you)）的(de)濃(nong)度，特(te)別是(shi)當它們(men)可能(neng)幹(gan)擾(rao)酶的活性(xing)時。

4.控制(zhi)反(fan)應(ying)溫度：

在酶(mei)的合(he)適的(de)溫(wen)度下進(jin)行(xing)反(fan)應(ying)，通(tong)常(chang)在37°C左(zuo)右，但具(ju)體(ti)溫度可能(neng)因(yin)酶(mei)而(er)異。

5.使(shi)用(yong)專門的(de)緩(huan)沖(chong)液：

使(shi)用為特(te)定限制(zhi)酶(mei)設(she)計(ji)的(de)緩(huan)沖(chong)液，這(zhe)些緩(huan)沖(chong)液已(yi)經(jing)過(guo)優化(hua)，以(yi)減(jian)少(shao)星號活性(xing)的(de)風(feng)險。

6.避(bi)免(mian)使用(yong)替代的二價陽離子(zi)：

如(ru)果可能(neng)，避(bi)免(mian)在反(fan)應(ying)中添(tian)加(jia)可能(neng)幹(gan)擾(rao)Mg2+功能(neng)的其他(ta)二價陽離子(zi)。

7.實(shi)驗(yan)前(qian)測試(shi)：

在進(jin)行(xing)大(da)規模的DNA切(qie)割(ge)反應之前(qian)，先在(zai)小規模反應(ying)中測(ce)試(shi)酶的(de)活性(xing)和(he)特(te)異性(xing)。

8.序(xu)列(lie)分(fen)析(xi)：

如(ru)果可能(neng)，對DNA模板(ban)進(jin)行(xing)序(xu)列(lie)分(fen)析(xi)，確保(bao)沒有(you)與限制(zhi)酶(mei)識(shi)別序(xu)列相(xiang)似的(de)非目標(biao)序列(lie)。

     限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei)的星號活性(xing)是(shi)分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)實驗中需要特(te)別註(zhu)意(yi)的現象。了解(jie)和(he)控制(zhi)這(zhe)些(xie)影響(xiang)因(yin)素對於確(que)保(bao)酶切(qie)反(fan)應的特(te)異性(xing)和(he)效(xiao)率是重(zhong)要的(de)。通(tong)過(guo)優化(hua)實驗(yan)條件(jian)，可以(yi)減(jian)少(shao)星號活性(xing)的(de)發生(sheng)，從而(er)獲(huo)得更可靠(kao)的實驗結(jie)果(guo)。

     蘇州阿(e)爾法(fa)生(sheng)物作(zuo)為百時美(mei)的聯(lian)盟供(gong)應商(shang)提供(gong)實驗(yan)室儀器設備(bei)， 實驗(yan)耗(hao)材，生(sheng)物試(shi)劑的壹站(zhan)式服務(wu)，所(suo)提供(gong)的分(fen)子(zi)生(sheng)物學(xue)試劑主要包(bao)括(kuo)：限制(zhi)性(xing)內(nei)切(qie)酶(mei) ，taq聚(ju)合酶(mei)，逆轉試劑盒，熒(ying)光(guang)定量(liang)試(shi)劑、體外轉錄(lu)酶(mei)等(deng)。