影(ying)響(xiang)pcr擴增(zeng)效率(lv)因素(su)是什(shen)麽？

基因擴(kuo)增儀(yi)，通常指(zhi)的(de)是聚(ju)合(he)酶(mei)鏈反應（PCR）儀器(qi)，是壹種在(zai)分(fen)子生(sheng)物(wu)學實驗(yan)中(zhong)廣泛使用(yong)的(de)工具，用(yong)於擴(kuo)增特定的(de)DNA片(pian)段。影響(xiang)pcr擴增(zeng)效率(lv)因素(su)有(you)哪些(xie)？

基因擴(kuo)增儀(yi)的(de)基本原理

在(zai)介(jie)紹(shao)影響(xiang)基因擴(kuo)增因素(su)之(zhi)前，我們先簡單回(hui)顧壹下(xia)PCR的(de)基本原理。PCR包括(kuo)三(san)個主(zhu)要(yao)步(bu)驟：變性(xing)（Denaturation）、退(tui)火（Annealing）和延伸（Extension）。通過(guo)這三(san)個步(bu)驟的(de)循(xun)環，目標(biao)DNA片段得(de)以指(zhi)數(shu)級擴增。  

基因擴(kuo)增儀(yi)擴增效率(lv)影(ying)響(xiang)因素(su)

1. DNA模板(ban)的(de)質(zhi)量和濃(nong)度(du)：

質(zhi)量：模板(ban)DNA的(de)純(chun)度(du)對擴(kuo)增(zeng)效率(lv)有(you)著重(zhong)要(yao)影響(xiang)。汙(wu)染物(wu)，如(ru)蛋白(bai)質(zhi)、鹽類和有(you)機溶劑，也(ye)可(ke)能(neng)會抑制(zhi)Taq聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。

濃(nong)度(du)：模板(ban)DNA的(de)濃(nong)度(du)需(xu)要(yao)優(you)化(hua)。濃(nong)度(du)過(guo)低(di)可(ke)能(neng)導致擴增(zeng)失敗(bai)，而濃度(du)過(guo)高則(ze)可(ke)能(neng)導致非(fei)特異性(xing)擴(kuo)增(zeng)。

2.引物(wu)的(de)設(she)計：

引(yin)物(wu)是PCR反應的(de)關(guan)鍵(jian)，它們決(jue)定了(le)擴增(zeng)的(de)特異性(xing)和效率(lv)。引(yin)物(wu)的(de)長(chang)度(du)、GC含(han)量、熔(rong)點溫度(du)（Tm）以及它(ta)們之(zhi)間(jian)的(de)互(hu)補(bu)性(xing)都(dou)是需(xu)要(yao)考(kao)慮的(de)因素(su)。如(ru)果引物(wu)設(she)計不(bu)當可(ke)能(neng)導致非(fei)特異性(xing)擴(kuo)增(zeng)或擴增(zeng)失敗(bai)。

2. dNTPs的(de)濃(nong)度(du)：

dNTPs（四(si)種脫(tuo)氧核苷三(san)磷酸）是DNA合成的(de)原(yuan)料(liao)。它(ta)們的(de)濃(nong)度(du)需(xu)要(yao)平衡，既不能(neng)太(tai)低(di)，也(ye)不能太(tai)高(gao)。過(guo)高的(de)dNTPs濃(nong)度(du)可(ke)能(neng)導致聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)錯(cuo)誤摻入，而濃度(du)過(guo)低(di)則(ze)可(ke)能(neng)減慢反應速度(du)。

3.Taq聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)：

Taq聚(ju)合(he)酶(mei)是PCR反應中(zhong)的(de)催化(hua)劑(ji)。酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)、純(chun)度(du)和濃(nong)度(du)都(dou)會影(ying)響(xiang)擴增(zeng)效率(lv)。酶(mei)的(de)保(bao)存和使(shi)用(yong)條(tiao)件(jian)需(xu)要(yao)嚴(yan)格(ge)遵(zun)守制(zhi)造商的(de)指(zhi)南。實驗(yan)室(shi)如(ru)果考(kao)慮成本價格(ge)的(de)話(hua)，也可(ke)以選擇國(guo)產(chan)taq聚(ju)合(he)酶(mei)，百時(shi)美(mei)生(sheng)產(chan)的(de)taq聚(ju)合(he)酶(mei)價格(ge)相當於進(jin)口酶(mei)的(de)1/5，不(bu)僅(jin)可(ke)以通用buffer，而且(qie)效率(lv)也(ye)不錯。

4.反應緩沖(chong)液：

緩沖(chong)液的(de)成(cheng)分(fen)和pH值(zhi)會(hui)直(zhi)接(jie)影(ying)響(xiang)到(dao)PCR反應速度(du)。緩沖(chong)液通(tong)常包含(han)Tris-HCl、KCl和MgCl2，它(ta)們分(fen)別維持(chi)pH值(zhi)、離子強(qiang)度(du)和提供Mg2+，後(hou)者(zhe)是Taq聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)輔助因子。

5.Mg2+濃度(du)：

Mg2+是Taq聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)必(bi)需(xu)輔因子。Mg2+濃度(du)對PCR的(de)效率(lv)和特異性(xing)都(dou)會(hui)有(you)影響(xiang)。如(ru)果Mg2+濃度(du)過(guo)低(di)可(ke)能(neng)導致酶(mei)活性(xing)降(jiang)低(di)，而(er)濃度(du)過(guo)高則(ze)可(ke)能(neng)導致非(fei)特異性(xing)擴(kuo)增(zeng)。

6.循環參(can)數(shu)：

變性(xing)溫度(du)和時(shi)間(jian)：變(bian)性(xing)溫度(du)和時(shi)間(jian)的(de)選擇取(qu)決(jue)於多種(zhong)因素(su)，包括(kuo)DNA的(de)序(xu)列(lie)、長(chang)度(du)以及反應體(ti)系(xi)中(zhong)使用(yong)的(de)引(yin)物(wu)。

變性(xing)溫度(du)：

變(bian)性(xing)溫度(du)通(tong)常設(she)定在(zai)90-95°C之(zhi)間(jian)。這個(ge)溫度(du)範(fan)圍足以破壞DNA雙鏈之(zhi)間(jian)的(de)氫(qing)鍵(jian)，使其分(fen)離成(cheng)單(dan)鏈。以下(xia)是壹些常見(jian)的(de)變(bian)性(xing)溫度(du)設(she)定：

94°C：這是壹個常用(yong)的(de)變(bian)性(xing)溫度(du)，適用(yong)於大(da)多數(shu)標(biao)準(zhun)的(de)PCR反應。

95°C：有(you)時用(yong)於確保變(bian)性(xing)，尤(you)其是當模板(ban)DNA的(de)GC含(han)量較高(gao)時。

92-93°C：有(you)時用(yong)於減(jian)少(shao)非(fei)特異性(xing)擴(kuo)增(zeng)，尤其是在(zai)擴(kuo)增低(di)熔(rong)點溫度(du)（Tm）的(de)DNA片(pian)段時。

變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)

變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)通(tong)常(chang)在(zai)15-30秒(miao)之(zhi)間(jian)，具(ju)體(ti)時間(jian)取(qu)決(jue)於PCR儀(yi)的(de)熱(re)傳(chuan)遞效率(lv)和反應體(ti)積。以下(xia)是壹些常見(jian)的(de)變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)設(she)定：

15-20秒(miao)：對於大(da)多數(shu)標(biao)準(zhun)PCR反應，這個(ge)時間(jian)範(fan)圍通常(chang)足夠。

30秒(miao)：在(zai)較大(da)的(de)反應體(ti)積或者當使用(yong)某(mou)些(xie)PCR儀器時，可(ke)能(neng)需(xu)要(yao)更長(chang)的(de)變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)以確保均(jun)勻的(de)熱(re)傳(chuan)遞。

需(xu)要(yao)註意的(de)是，變性(xing)時(shi)間(jian)不(bu)宜過(guo)長，因為(wei)過(guo)長的(de)變(bian)性(xing)時(shi)間(jian)可(ke)能(neng)會導致DNA模板(ban)的(de)降(jiang)解(jie)，尤其是當模板(ban)中(zhong)含(han)有(you)熱不(bu)穩定(ding)的(de)序(xu)列(lie)時(shi)。同(tong)時，如(ru)果變性(xing)時(shi)間(jian)太(tai)短(duan)，可(ke)能(neng)無法實現(xian)變(bian)性(xing)，導(dao)致(zhi)PCR效率(lv)降(jiang)低(di)。

退(tui)火溫度(du)和時(shi)間(jian)：退(tui)火溫度(du)需(xu)要(yao)根據引(yin)物(wu)的(de)Tm來(lai)優(you)化(hua)。溫度(du)太(tai)低(di)可(ke)能(neng)導致非(fei)特異性(xing)結合，而溫度(du)太(tai)高則(ze)可(ke)能(neng)阻止引物(wu)與模板(ban)的(de)結合。

延伸溫度(du)和時(shi)間(jian)：延伸溫度(du)通(tong)常設(she)定在(zai)Taq聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)最佳活(huo)性(xing)溫度(du)，而(er)延伸時間(jian)需(xu)要(yao)足夠讓聚(ju)合(he)酶(mei)完(wan)成目標(biao)DNA片段的(de)合(he)成。

儀器(qi)性(xing)能(neng)：PCR儀(yi)器的(de)性(xing)能(neng)，如(ru)溫度(du)控(kong)制(zhi)的(de)精(jing)確度(du)和均(jun)勻性(xing)，也(ye)會(hui)影響(xiang)擴增(zeng)效率(lv)。性(xing)能(neng)不(bu)佳的(de)儀(yi)器可(ke)能(neng)導致溫度(du)波(bo)動，從而(er)影(ying)響(xiang)反應的(de)重(zhong)復性(xing)和可(ke)靠(kao)性(xing)。T10C朗基梯度(du)PCR儀(yi)以其創新(xin)的(de)設(she)計和高(gao)效性(xing)能(neng)，為(wei)PCR擴(kuo)增(zeng)效率(lv)的(de)提升(sheng)提供了(le)有(you)力支持。該儀(yi)器(qi)配備(bei)的(de)96*0.2ml/0.1ml模塊(kuai)，能夠靈(ling)活適應不同(tong)規(gui)格(ge)的(de)PCR管(guan)，包括(kuo)8聯(lian)管，提高了(le)實驗(yan)的(de)便(bian)捷(jie)性(xing)和多樣(yang)性(xing)。另外，它允(yun)許(xu)用戶(hu)在(zai)同(tong)壹臺儀器(qi)上(shang)同(tong)時進行(xing)多個(ge)不(bu)同(tong)溫度(du)和時(shi)間(jian)的(de)PCR反應，較大(da)地提高了(le)實驗(yan)效率(lv)和靈(ling)活性(xing)。TC-10基因擴(kuo)增儀(yi)采用的(de)MARLOW半(ban)導體(ti)芯(xin)片(pian)技(ji)術(shu)，使得(de)升(sheng)溫速(su)率(lv)達(da)到(dao)9℃/秒(miao)，可(ke)以快速達到(dao)目標(biao)溫度(du)，縮(suo)短了(le)實驗(yan)周期(qi)。

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