酶切(qie)反應(ying)的原理(li)和實驗(yan)步驟

在(zai)分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學實驗中(zhong)，酶切反應(ying)是壹種(zhong)常(chang)用的(de)技術手段，主要用於將(jiang)DNA分(fen)子(zi)切(qie)割(ge)成特定(ding)的片(pian)段。這壹(yi)過程(cheng)對(dui)於基(ji)因(yin)克隆、基因(yin)表(biao)達(da)分(fen)析等(deng)實驗(yan)比較重要。

壹、酶(mei)切反應(ying)的原理(li)

酶切反應(ying)利(li)用限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶（restriction enzyme）識(shi)別(bie)特定(ding)的DNA序(xu)列，並(bing)在(zai)這(zhe)些序(xu)列上(shang)切割(ge)DNA分(fen)子。限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶分(fen)為(wei)三類：Type I、Type II和Type III。在(zai)實(shi)驗(yan)室(shi)中(zhong)，常(chang)用的(de)是Type II限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶，它們(men)通(tong)常(chang)識別(bie)6個堿(jian)基(ji)對(dui)的(de)回文(wen)序(xu)列。

二、實(shi)驗(yan)材料

1. 純化(hua)的(de)DNA模(mo)板：1μg

2. 限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶：根(gen)據實驗(yan)需求選(xuan)擇合(he)適的酶

3. 1×CutOneTM Buffer：20 μl

4. 離心(xin)管(guan)

5. 槍頭(tou)

6. 離(li)心(xin)機(ji)

三(san)、酶切反應(ying)實驗步(bu)驟(zhou)

1. 反應(ying)體系配(pei)制(zhi)

（1）在(zai)離(li)心(xin)管(guan)中加入(ru)1μg經過(guo)純化(hua)的(de)DNA模(mo)板。

（2）根(gen)據所選(xuan)限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶的(de)推薦比例(li)，加入(ru)適量的(de)酶(mei)。例(li)如，如(ru)果(guo)使(shi)用1 U限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶可(ke)以(yi)全(quan)酶(mei)切1μg DNA，那(na)麽(me)在(zai)本(ben)實(shi)驗(yan)中(zhong)，我(wo)們需要加入(ru)1 U的酶(mei)。

（3）向離(li)心(xin)管(guan)中加入(ru)1×CutOneTM Buffer，使總體積(ji)達(da)到(dao)20 μl。

（4）在(zai)雙(shuang)酶(mei)切(qie)實(shi)驗中，為(wei)防止(zhi)總酶(mei)量超過總體積(ji)的10%，可(ke)以(yi)適當擴大反應(ying)體系。例(li)如，可(ke)以(yi)將(jiang)總體積(ji)擴大至40 μl。

2. 混(hun)勻反應(ying)體系

（1）在(zai)加(jia)入(ru)所有試(shi)劑(ji)後，用(yong)槍(qiang)頭(tou)輕(qing)輕吹打(da)3到(dao)5次，以確保(bao)反應(ying)體系充分混(hun)勻。

（2）另外(wai)，也可(ke)以(yi)用(yong)手指(zhi)輕彈(dan)管(guan)壁，幫助混(hun)勻反應(ying)體系。

（3）註(zhu)意：不(bu)要渦旋(xuan)反應(ying)體系，劇(ju)烈(lie)震(zhen)蕩(dang)會嚴(yan)重影響酶的活性(xing)。

3. 瞬(shun)離反應(ying)體系

將(jiang)混(hun)勻後的(de)反應(ying)體系放入(ru)離心(xin)機(ji)中(zhong)，進(jin)行(xing)瞬(shun)離（短(duan)暫(zan)離心(xin)），以(yi)使反應(ying)體系中(zhong)的(de)試(shi)劑(ji)充分接(jie)觸(chu)。

4. 孵(fu)育反應(ying)體系

（1）將(jiang)離(li)心(xin)管(guan)放入(ru)預設(she)溫(wen)度(du)的恒溫培養箱(xiang)中，進行(xing)酶(mei)切反應(ying)。

（2）註(zhu)意：不(bu)要孵(fu)育超過酶的星(xing)活性(xing)出現(xian)時(shi)間(jian)。星活性(xing)出現(xian)時(shi)間(jian)請(qing)查(zha)閱(yue)各酶說明書(shu)。

5. 停(ting)止(zhi)反應(ying)

酶切反應(ying)完成後，取出離心(xin)管(guan)，置於冰(bing)上(shang)，以停(ting)止(zhi)酶的(de)活性(xing)。

6. 酶切(qie)產物(wu)的(de)檢測

（1）通(tong)過瓊(qiong)脂糖(tang)凝(ning)膠(jiao)電泳檢測酶(mei)切(qie)產物(wu)。

（2）根(gen)據電泳結(jie)果(guo)，分析酶(mei)切是(shi)否(fou)成功。

四(si)、註(zhu)意事(shi)項(xiang)

1. 確保(bao)DNA模(mo)板的(de)純度(du)，避免雜質對(dui)酶(mei)切反應(ying)的影響(xiang)。

2. 嚴(yan)格按(an)照限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶的(de)推薦比例(li)和反應(ying)條件(jian)進(jin)行實驗。

3. 在(zai)操(cao)作過程(cheng)中(zhong)，盡(jin)量避免劇烈震(zhen)蕩(dang)，以免影(ying)響酶(mei)的(de)活性(xing)。

4. 酶切(qie)反應(ying)過程(cheng)中(zhong)，註(zhu)意觀察反應(ying)體系的(de)顏(yan)色(se)變化(hua)，以(yi)判斷(duan)酶的活性(xing)。

5. 酶切(qie)反應(ying)完成後，及時(shi)停(ting)止(zhi)反應(ying)，避免過度(du)酶切。

掌(zhang)握實(shi)驗(yan)室(shi)酶切反應(ying)的具體操(cao)作流(liu)程(cheng)，對(dui)於順利(li)進行(xing)分(fen)子(zi)生物(wu)學實驗(yan)具有重要意義。

 國(guo)產酶(mei)生(sheng)產面臨(lin)的主(zhu)要難(nan)點包括(kuo)技術(shu)壁(bi)壘(lei)、生產規(gui)模(mo)和質(zhi)量控(kong)制(zhi)、市(shi)場(chang)準入(ru)和影(ying)響力、供應鏈(lian)和(he)分銷(xiao)網(wang)絡以及技(ji)術(shu)標(biao)準和(he)規範(fan)。技術(shu)壁壘(lei)體現(xian)在(zai)專(zhuan)業(ye)人(ren)才(cai)不足(zu)和研(yan)發投入(ru)較少(shao)，導致技術積累(lei)不(bu)足(zu)。生產規(gui)模(mo)較小和質量控(kong)制(zhi)難(nan)度(du)大使得(de)生產成本(ben)高(gao)且質量難(nan)以保(bao)證。市(shi)場(chang)準入(ru)門(men)檻高(gao)和(he)影(ying)響(xiang)力不足(zu)限制(zhi)了國(guo)產酶(mei)的(de)市(shi)場(chang)認(ren)可(ke)度(du)。

百時美(mei)生(sheng)物(wu)作為(wei)為(wei)數(shu)不(bu)多(duo)的國(guo)產內(nei)切(qie)酶(mei)生產商(shang)之(zhi)壹，具(ju)備(bei)較為(wei)完備(bei)的供應鏈(lian)管(guan)理(li)體系和(he)成熟(shu)的(de)技(ji)術(shu)儲備(bei)，目(mu)前(qian)生(sheng)產的(de)限制(zhi)酶種(zhong)類已(yi)達(da)90多(duo)種(zhong)，且具有酶(mei)切(qie)速(su)度(du)快，兼容(rong)性(xing)高(gao)，在(zai)酶(mei)切(qie)反應(ying)實驗中(zhong)可(ke)以(yi)實(shi)現(xian)共用(yong)buffer,雙(shuang)酶(mei)切(qie)，多(duo)酶切等。

蘇州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物(wu)作為(wei)百事美(mei)的(de)聯(lian)盟供應商(shang)提供實驗室(shi)儀器(qi)設(she)備(bei)，實驗耗(hao)材，生(sheng)物試劑(ji)的(de)壹(yi)站(zhan)式(shi)服務，所提供的分子(zi)生物(wu)學試(shi)劑(ji)主(zhu)要包括(kuo)：限制(zhi)性(xing)內切(qie)酶，taq聚合(he)酶，逆(ni)轉(zhuan)試劑(ji)盒，熒光定(ding)量試(shi)劑(ji)、體外(wai)轉(zhuan)錄酶(mei)等。