實時(shi)熒(ying)光定量(liang) PCR（RT-QPCR）技術(shu)是(shi)壹(yi)種高(gao)靈敏(min)度(du)的分(fen)子(zi)生(sheng)物(wu)學檢(jian)測方法(fa)，廣(guang)泛應(ying)用於生命科(ke)學(xue)研究(jiu)的多個領域。本文將詳(xiang)細(xi)介紹(shao)使(shi)用(yong) Q2000B 熒(ying)光定量(liang) PCR 儀進行(xing) RT-QPCR 實驗(yan)的(de)操作(zuo)流程，幫助(zhu)讀(du)者更好地(di)理(li)解和應(ying)用這(zhe)壹(yi)技術。
壹(yi)、實驗(yan)前準備(bei)
在進行(xing)實時(shi)熒(ying)光定量(liang) PCR 實驗(yan)前，需要(yao)準(zhun)備(bei)好實驗(yan)所需的(de)各(ge)種試劑(ji)和耗(hao)材。試劑(ji)包括(kuo)特異性 PCR 引物(wu)、新(xin)鮮(xian)提(ti)取的(de)總 RNA 以及相(xiang)關的試(shi)劑(ji)盒。此外，還需要(yao)確(que)認所需的(de)儀器(qi)和耗(hao)材，如(ru)實時(shi)定量(liang) PCR 儀、多(duo)孔板(ban)等(deng)。
二、反轉(zhuan)錄反應(ying)
1. 配置(zhi)反轉(zhuan)錄反應(ying)體系：包括(kuo)模板(ban)、引物(wu)、dNTP 混合物(wu)等。
2. 進行(xing)反轉(zhuan)錄反應(ying)：使(shi)用(yong)總(zong) RNA 合成 cDNA 第壹(yi)鏈。
三、Q-PCR 擴(kuo)增(zeng)
1. 配(pei)置(zhi) PCR 反應(ying)體系：包括(kuo) cDNA 產物(wu)、Master Mix、引物(wu)等。
2. 設(she)置(zhi) PCR 程序(xu)，包括(kuo)預變(bian)性、擴(kuo)增(zeng)循環(huan)、延(yan)伸等(deng)步(bu)驟(zhou)。
3. 運(yun)行 PCR 實驗(yan)，實時(shi)監測樣品擴(kuo)增(zeng)情(qing)況。
四(si)、數(shu)據(ju)分(fen)析
1. 樣品編輯：設置(zhi)陰性對(dui)照、空(kong)白對(dui)照、標(biao)準品和未知(zhi)樣品等。
2. 結(jie)果分(fen)析：查看(kan)擴(kuo)增(zeng)曲線、標(biao)準曲線、Cp 值等數(shu)據(ju)。
五(wu)、Q2000B 熒(ying)光定量(liang) PCR 儀的(de)特點
1.角度(du)調節(jie)屏(ping)幕(mu)：儀器(qi)屏幕角度(du)可(ke) 90° 調節(jie)，適(shi)合不同視(shi)角(jiao)使(shi)用(yong)。
2. 同步(bu)熒(ying)光檢(jian)測：相(xiang)同通(tong)道的(de)熒(ying)光檢(jian)測同步(bu)，延(yan)時(shi)誤差減少。
3. 全(quan)真(zhen)彩觸控屏：自帶 10 英(ying)寸(cun)全真(zhen)彩觸控屏，可(ke)以在屏幕(mu)上(shang)編輯、查看(kan)、運(yun)行的(de)定量(liang) PCR 和普通 PCR 程序(xu)，無(wu)需(xu)連(lian)接(jie)電腦。
4. 新(xin)壹(yi)代(dai)半(ban)導(dao)體升降(jiang)溫(wen)技(ji)術(shu)：采用(yong)進口(kou)半(ban)導體芯片(pian)，變(bian)溫(wen)速(su)率可(ke)達(da) 6 °C/SEC，使(shi)用(yong)壽(shou)命達(da) 100 萬次(ci)循環(huan)。
5. 頂(ding)部檢(jian)測技術(shu)：采用(yong)頂(ding)部檢(jian)測技術(shu)，屏蔽(bi)背(bei)景幹擾，提高(gao)熒(ying)光信號(hao)靈敏(min)度(du)和信噪比(bi)，可(ke)使(shi)用(yong)白管和透(tou)明(ming)管，獲(huo)得(de)準確(que)結(jie)果。
6. 溫(wen)度(du)梯度(du)功能(neng)：具(ju)有(you)溫(wen)度(du)梯度(du)功能(neng)，優(you)化反應(ying)條件，並配(pei)有(you)遠程(cheng)操控，實時(shi)查看(kan)實驗(yan)數(shu)據(ju)及分(fen)析結(jie)果。
7. SSLPTM 短光(guang)程靜(jing)態(tai)熒(ying)光 CCD 成像技術(shu)：采用(yong) SSLPTM 短光(guang)程靜(jing)態(tai)熒(ying)光 CCD 成像技術(shu)，熒(ying)光信號(hao)穩(wen)定、靈(ling)敏(min)。
六、熒(ying)光定量(liang) PCR 實驗(yan)操(cao)作流程
1. 打開 Q2000B 熒(ying)光定量(liang) PCR 儀，確(que)認(ren)儀器(qi)設置(zhi)正確(que)。
2. 在全真(zhen)彩觸控屏上(shang)編輯 RT-QPCR 實驗(yan)程(cheng)序，包括(kuo)預變(bian)性、擴(kuo)增(zeng)循環(huan)、延(yan)伸等(deng)步(bu)驟(zhou)。
3. 配置(zhi) PCR 反應(ying)體系，加(jia)入 cDNA 產物(wu)、Master Mix、引物(wu)等。
4. 將(jiang)反應(ying)體系分(fen)裝(zhuang)至多(duo)孔板(ban)中(zhong)，設(she)置(zhi)陰性對(dui)照、空(kong)白對(dui)照、標(biao)準品和未知(zhi)樣品等。
5. 將多孔板(ban)放(fang)入 Q2000B 熒(ying)光定量(liang) PCR 儀中(zhong)，啟動(dong)實驗(yan)程(cheng)序。
6. 實時(shi)監測樣品擴(kuo)增(zeng)情(qing)況，觀(guan)察擴(kuo)增(zeng)曲線、標(biao)準曲線、Cp 值等數(shu)據(ju)。
7. 實驗(yan)結(jie)束(shu)後(hou)，對(dui)數(shu)據(ju)進行(xing)分(fen)析，計算(suan)樣(yang)品中(zhong)目(mu)的基(ji)因(yin)的(de)濃(nong)度(du)。
七、註(zhu)意事(shi)項(xiang)
1. 確(que)保(bao)所有 RNA 相(xiang)關的操(cao)作均佩戴手(shou)套(tao)，防(fang)止 RNase 汙(wu)染(ran)。
2. 嚴格(ge)按(an)照試劑(ji)盒說(shuo)明進行(xing)操(cao)作，避(bi)免使(shi)用(yong)渦(wo)旋(xuan)振(zhen)蕩。
3. 確(que)保(bao) PCR 儀器(qi)的正確(que)設置(zhi)，以獲(huo)得(de)準確(que)的擴(kuo)增(zeng)結(jie)果。
4. 試劑(ji)需在規定條件下(xia)儲存(cun)和使(shi)用(yong)，如(ru) SYBR Green I Master 需(xu)避(bi)光放(fang)置(zhi)。
5. 註(zhu)意數(shu)據(ju)分(fen)析方法(fa)的選(xuan)擇，如(ru)標(biao)準曲線法、絕對(dui)定量(liang)法等(deng)。
Q2000B 熒(ying)光定量(liang) PCR 儀 能(neng)夠(gou)提供(gong)高(gao)靈敏(min)度(du)和高(gao)準確(que)度(du)的 RT-QPCR 實驗(yan)結(jie)果。通過(guo)合理選(xuan)擇實驗(yan)方法(fa)、嚴謹(jin)操作和準確分(fen)析，可(ke)以確(que)保(bao)實驗(yan)結(jie)果的可(ke)靠性和準確性。掌(zhang)握該技術(shu)的基(ji)本(ben)原(yuan)理(li)和操作要點，對(dui)於提高(gao)科研水平(ping)和醫學研究(jiu)能力具(ju)有(you)重(zhong)要(yao)意(yi)義(yi)。更多實驗(yan)室(shi)儀器(qi)設備請進入(ru)蘇(su)州阿爾法生(sheng)物(wu)網站(zhan)進行(xing)了解。
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更新(xin)時(shi)間(jian)：2024-08-16
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