實時熒(ying)光定量PCR技(ji)術介紹

實時熒(ying)光定量PCR（qPCR）是(shi)壹種(zhong)在(zai)PCR反(fan)應(ying)體系(xi)中加入熒(ying)光基(ji)團(tuan)，利(li)用熒光信(xin)號累(lei)積(ji)實時監(jian)測整個PCR進(jin)程，最後(hou)通過標(biao)準(zhun)曲線對初(chu)始模板(ban)進行定量分析(xi)的方(fang)法。該(gai)技(ji)術於(yu)1996年由(you)美(mei)國(guo)Applied Biosystems公(gong)司推出，它(ta)的出現解(jie)決了傳(chuan)統(tong)PCR不(bu)能(neng)對初(chu)始模板(ban)定量分析(xi)的問題(ti)。熒(ying)光定量PCR具有準確(que)性高、靈(ling)敏(min)度(du)高、特(te)異(yi)性強(qiang)等優點(dian)，目前(qian)已(yi)廣(guang)泛(fan)應用於(yu)分子生物學(xue)研(yan)究(jiu)和(he)醫(yi)學研究等領(ling)域(yu)。

熒光定量PCR原(yuan)理(li)

在PCR反(fan)應體系(xi)中加入熒(ying)光基(ji)團(tuan)，隨著(zhe)PCR反(fan)應的進行(xing)，PCR反應產物不(bu)斷累(lei)積(ji)，熒光信(xin)號強(qiang)度(du)也等比例(li)增加(jia)。每經(jing)過壹個循(xun)環收(shou)集壹(yi)個熒(ying)光強(qiang)度(du)信(xin)號，通過熒(ying)光強(qiang)度(du)變(bian)化檢測產物量的變化，末(mo)了得(de)到(dao)壹(yi)條(tiao)熒光擴(kuo)增曲線圖，擴(kuo)增曲線橫(heng)坐標(biao)表(biao)示循(xun)環數(shu)，縱坐標(biao)表(biao)示熒(ying)光強(qiang)度(du)。

熒(ying)光定量PCR常用術語(yu)

1. 基線：實時熒(ying)光定量PCR反應的基線是(shi)指在PCR的最初(chu)幾(ji)個(ge)循環中（壹般(ban)為(wei)3-15個(ge)循環）的信(xin)號水(shui)平。此(ci)階(jie)段的熒光信(xin)號變(bian)化量極(ji)小。

2. 熒(ying)光閾(yu)值：熒光閾(yu)值是(shi)在熒光擴(kuo)增曲線上(shang)人(ren)為(wei)設(she)定的壹個(ge)值，它可以(yi)設(she)定在熒(ying)光信(xin)號指數(shu)擴(kuo)增階(jie)段任意位置上(shang)，壹般(ban)熒光閾(yu)值默認(ren)是(shi)PCR 3-15個循環熒光信(xin)號標(biao)準偏差(cha)的10倍。

3. Ct值：Ct值指的是(shi)PCR擴(kuo)增過(guo)程中擴(kuo)增產物的熒光信(xin)號達(da)到(dao)設(she)定的閾(yu)值時所經(jing)過的循環數(shu)。

4. 標準曲線：標準(zhun)曲線是(shi)標準物質(zhi)的物理(li)/化學屬(shu)性跟儀器(qi)響應(ying)之(zhi)間的函數(shu)關系(xi)。對已(yi)知拷貝(bei)數(shu)的標準(zhun)樣品(pin)做系(xi)列稀(xi)釋，對不(bu)同(tong)稀(xi)釋度(du)的標準(zhun)樣品(pin)進行熒(ying)光定量PCR並記錄Ct值，根據(ju)Ct值及(ji)拷貝(bei)數(shu)的對數(shu)繪制(zhi)得(de)到(dao)標(biao)準(zhun)曲線，標準(zhun)曲線的縱坐標(biao)代(dai)表(biao)起始拷(kao)貝(bei)數(shu)的對數(shu)，橫(heng)坐標(biao)代(dai)Ct值。

5. 實現對初(chu)始模板(ban)的定量

6. 利(li)用實時熒(ying)光定量 PCR對樣(yang)品(pin)的初(chu)始模板(ban)量進行定量分析(xi)，需(xu)要(yao)利(li)用已知(zhi)起始拷(kao)貝(bei)數(shu)的標準(zhun)品(pin)作出標(biao)準(zhun)曲線，再(zai)通過熒(ying)光定量PCR獲得(de)未(wei)知(zhi)樣(yang)品(pin)的Ct值，最後(hou)從標(biao)準曲線上(shang)計算(suan)出該(gai)樣品(pin)的起始拷(kao)貝(bei)數(shu)。

7. 標準曲線繪制(zhi)

8. 標(biao)準(zhun)品(pin)的制(zhi)備：設(she)計特定引(yin)物，利(li)用PCR對目的基因片段進行(xing)擴(kuo)增，隨後(hou)將目的基因片段克隆至載體中，測序驗證(zheng)是(shi)否(fou)為(wei)陽(yang)性重組(zu)質(zhi)粒，最後(hou)收(shou)集陽(yang)性克隆質粒作(zuo)為(wei)標(biao)準品(pin)。

9. 繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲線：測定質粒的濃度(du)，依(yi)據(ju)公(gong)式計算(suan)出質(zhi)粒的拷貝(bei)數(shu)。對質(zhi)粒進(jin)行(xing)系(xi)列稀(xi)釋，分別(bie)作為(wei)模板(ban)進行熒光定量PCR並記錄Ct值。最後(hou)依(yi)據(ju)起始拷(kao)貝(bei)數(shu)的對數(shu)及(ji)Ct值繪制(zhi)標(biao)準(zhun)曲線，得(de)到(dao)標(biao)準(zhun)方(fang)程。當需(xu)要(yao)對起始模板(ban)進行定量時，只(zhi)需(xu)要得(de)到(dao)擴(kuo)增曲線，讀得(de)Ct值，帶(dai)入標(biao)準(zhun)方(fang)程即可對起始模板(ban)定量。

熒(ying)光標(biao)記(ji)方(fang)法

熒(ying)光定量PCR熒光標(biao)記(ji)方(fang)法可分為(wei)熒(ying)光染料法和(he)熒光探(tan)針(zhen)法兩類。

• 熒(ying)光染料：染料法是(shi)利(li)用熒光染料可以(yi)嵌(qian)合到(dao)DNA雙(shuang)鏈(lian)內部(bu)的特性，來指示擴(kuo)增產物的增加(jia)。

• 熒(ying)光探(tan)針(zhen)：探(tan)針(zhen)為(wei)壹(yi)段寡核(he)苷(gan)酸(suan)，可與(yu)DNA序(xu)列特(te)異(yi)性結合，壹個模板(ban)結合壹個探(tan)針(zhen)。探(tan)針(zhen)5’端具(ju)有(you)報告(gao)基團(tuan)（R），可發(fa)光；3’端有(you)熒(ying)光淬(cui)滅基(ji)團(tuan)（Q），能吸收(shou)光。探(tan)針(zhen)完整(zheng)時R基(ji)團(tuan)所發(fa)射的熒光能(neng)量被Q基團(tuan)吸收(shou)，PCR儀檢測不(bu)到(dao)熒(ying)光信(xin)號。隨著(zhe)擴(kuo)增的進行(xing)，探(tan)針(zhen)會(hui)被聚合酶水(shui)解，報(bao)告(gao)基(ji)團(tuan)發(fa)出的光沒(mei)有(you)被(bei)淬(cui)滅基(ji)團(tuan)吸收(shou)，從而(er)被儀器(qi)檢測到(dao)。

熒(ying)光探(tan)針(zhen)與(yu)染料法對比

探(tan)針(zhen)法：特(te)異(yi)性高、重復性好，但只(zhi)適(shi)合壹個特定的目標(biao)，探(tan)針(zhen)價格(ge)較高。

染料法：對DNA模板(ban)沒有選擇(ze)性，適(shi)用於(yu)任何DNA，使用方(fang)便(bian)，成(cheng)本(ben)低，但容(rong)易與(yu)非特(te)異(yi)性雙鏈(lian)DNA結(jie)合，產生假(jia)陽(yang)性。

熒(ying)光定量PCR應用

  實時熒(ying)光PCR技(ji)術已廣泛(fan)應用於(yu)醫(yi)學及(ji)生命科學研究(jiu)的各個(ge)領(ling)域(yu)中。在科(ke)研(yan)方(fang)面可定量分析(xi)各種(zhong)基(ji)因的表(biao)達(da)分析(xi)，基(ji)因突變和多(duo)態性分析(xi)，單(dan)核(he)苷(gan)酸(suan)多態SNP測定及(ji)易位基(ji)因的檢測；在醫(yi)學方(fang)面可用於(yu)免疫(yi)組(zu)化分析(xi)、早(zao)期(qi)篩(shai)查(zha)、病(bing)原(yuan)體檢測、耐藥(yao)性分析(xi)、腫(zhong)瘤(liu)微(wei)小殘(can)留(liu)病變(bian)研究等。

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