PCR標(biao)準操作(zuo)流(liu)程(cheng)詳(xiang)解

PCR標(biao)準操作(zuo)流(liu)程(cheng)詳(xiang)解
壹(yi)、概述(shu)
聚(ju)合酶鏈(lian)式反(fan)應（Polymerase Chain Reaction，簡稱PCR）是壹(yi)種在(zai)體(ti)外合成雙鏈(lian)DNA的技(ji)術。其原(yuan)理(li)模仿(fang)了天(tian)然DNA的(de)復(fu)制過(guo)程，通(tong)過(guo)特異引物(wu)和(he)高特(te)異性酶，確保反(fan)應的特異性。典(dian)型(xing)的PCR反(fan)應包括(kuo)三(san)個(ge)步驟：變(bian)性、退(tui)火和(he)延(yan)伸，通(tong)過(guo)多次循環(huan)，最(zui)終獲得目(mu)標(biao)DNA片(pian)段。

二(er)、試(shi)劑(ji)準(zhun)備(bei)
以(yi)下為(wei)進行(xing)PCR反應所需(xu)的試(shi)劑(ji)及(ji)其(qi)終濃(nong)度(du)：

三(san)、操(cao)作(zuo)步驟
1. 配置(zhi)反應體(ti)系
將以下成分按順序加(jia)入(ru)0.5ml的離(li)心管(guan)中(zhong)：
l 加(jia)入(ru)PCR buffer。
l 加入(ru)dNTPs。
l 加入(ru)Forward primer。
l 加入(ru)Reverse primer。
l 加入(ru)Template DNA。
l 加入(ru)熱啟(qi)動(dong)酶。
l 用ddH2O補(bu)至(zhi)總(zong)體(ti)積50 ul。
註意：使用熱(re)啟動(dong)酶時(shi)，可在(zai)常溫下操作(zuo)；非熱(re)啟動(dong)型(xing)酶需(xu)在(zai)低溫下配置反應體(ti)系。 
2. 設(she)置(zhi)反(fan)應條件
根據(ju)試(shi)劑(ji)盒說明(ming)書設(she)置(zhi)反(fan)應時(shi)間(jian)和(he)溫度(du)，完(wan)成擴(kuo)增後(hou)進行(xing)電泳(yong)鑒(jian)定(ding)。

3. 瓊(qiong)脂(zhi)糖核酸電泳(yong)
①　準備電(dian)泳(yong)器(qi)具，用蒸(zheng)餾(liu)水洗(xi)凈並架(jia)好梳子。
② 根據(ju)所需(xu)分離(li)的DNA片(pian)段大小(xiao)，制備(bei)適當(dang)濃(nong)度(du)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝膠(jiao)。
③ 將瓊(qiong)脂(zhi)糖和(he)電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液（TAE或(huo)TBE）加入(ru)錐形瓶(ping)中，加(jia)熱(re)融化(hua)後(hou)冷卻(que)至(zhi)40℃左(zuo)右，混勻並倒(dao)入(ru)電泳(yong)槽。
④　室溫下凝固(gu)凝(ning)膠(jiao)，拔(ba)出梳(shu)子，準備(bei)點樣(yang)。
⑤　在(zai)電泳槽中加(jia)入(ru)電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液，確保覆(fu)蓋凝(ning)膠(jiao)表(biao)面。
⑥ 混合5ul樣(yang)品(pin)、1ul的(de)6xLoding buffer和(he)1ul染料(liao)，緩(huan)緩(huan)註入(ru)點樣(yang)孔，避(bi)免串孔。
⑦ 接(jie)通(tong)電源（紅(hong)正黑負），設(she)置(zhi)電(dian)壓(ya)40-60V，電泳時(shi)間(jian)30-40min，根據(ju)溴酚(fen)藍(lan)的位(wei)置判斷是(shi)否(fou)終止電(dian)泳(yong)。
⑧ 電(dian)泳結束後(hou)，關閉電源(yuan)，進行(xing)凝膠(jiao)成(cheng)像(xiang)觀察(cha)，並(bing)對比(bi)marker確定片(pian)段大小(xiao)。
不同瓊(qiong)脂(zhi)糖濃(nong)度(du)對應的DNA片(pian)段大小(xiao)如(ru)下表：

四、註意事項(xiang)
引物(wu)設(she)計(ji)
Ø 引物(wu)應設(she)計(ji)在(zai)cDNA的保守(shou)區域(yu)。
Ø 引物(wu)長度(du)應在(zai)15-28bp之間(jian)。
Ø GC含(han)量(liang)應在(zai)40%-60%之間(jian)。
Ø 避(bi)免引物(wu)自身(shen)形成(cheng)發(fa)夾結構，完成(cheng)後(hou)進行(xing)BLAST驗證(zheng)。

模板(ban)DNA
Ø 模板(ban)可以(yi)是單(dan)鏈(lian)或(huo)雙鏈(lian)DNA。
Ø 不同來(lai)源的(de)模板(ban)起始(shi)濃(nong)度(du)有(you)壹(yi)定要(yao)求(qiu)。
Ø 模板(ban)提取(qu)後(hou)應註意保(bao)存(cun)，避(bi)免降解。
其他
Ø 選(xuan)擇合適的(de)Taq DNA聚(ju)合酶。
Ø 確保四(si)種dNTP濃(nong)度(du)相(xiang)同。
Ø 操(cao)作(zuo)過(guo)程中(zhong)戴手(shou)套，保(bao)持(chi)環(huan)境(jing)幹凈，防(fang)止汙染(ran)。
Ø PCR用水(shui)需(xu)經過(guo)高壓(ya)滅菌(jun)或(huo)0.2um濾膜(mo)過(guo)濾。
五(wu)、常用試(shi)劑(ji)配(pei)方(fang)
電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液
50xTAE（pH8.5）
Tris 242g
EDTA（Na）37.2g
Ø 加(jia)入(ru)800ml去離(li)子水，攪(jiao)拌(ban)溶(rong)解
Ø 加入(ru)57.1ml乙酸，調(tiao)pH至(zhi)8.5後(hou)定(ding)容(rong)至(zhi)1L
10xTBE（pH8.3）
Tris 108g
EDTA 7.44g
硼(peng)酸55g
Ø 加入(ru)800ml去離(li)子水，攪(jiao)拌(ban)溶(rong)解，調(tiao)pH至(zhi)8.3後(hou)定(ding)容(rong)至(zhi)1L
上(shang)樣(yang)緩(huan)沖(chong)液（6xLoding buffer）
0.25%二(er)甲(jia)苯青(qing)
0.25%溴(xiu)酚(fen)藍(lan)

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