使用(yong)Cell Metric細胞(bao)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)進行(xing)單細(xi)胞克隆(long)篩選工藝開發流程(cheng)

在生物(wu)制(zhi)藥領(ling)域(yu)，單細(xi)胞克隆(long)篩選是藥(yao)物研(yan)發(fa)的(de)關(guan)鍵(jian)步(bu)驟(zhou)之(zhi)壹。FujiFilm Diosynth Biotechnologies公(gong)司(si)是(shi)壹家專註(zhu)於生(sheng)物制藥(yao)研(yan)發的公司(si)，他(ta)們(men)面(mian)臨(lin)著(zhe)快(kuai)速(su)產(chan)生(sheng)高(gao)產(chan)單細(xi)胞克隆(long)的(de)挑戰。為了應對這壹挑(tiao)戰，FujiFilm Diosynth Biotechnologies采(cai)用(yong)了Cell Metric高(gao)分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)，開發了壹種(zhong)快速(su)產(chan)生(sheng)高(gao)產(chan)單細(xi)胞克隆(long)並(bing)保(bao)證(zheng)高(gao)概率和高(gao)單克隆(long)源(yuan)性的(de)新(xin)工作(zuo)流(liu)程。本(ben)文將(jiang)詳細介(jie)紹使用(yong)Cell Metric高分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)進行(xing)單細(xi)胞克隆(long)篩選的相(xiang)關(guan)工(gong)藝開發流程(cheng)：

 1. 單細(xi)胞包(bao)裹到油基微滴(di)中

這壹步(bu)驟的實(shi)施主要是(shi)通(tong)過(guo)將(jiang)細胞(bao)與(yu)油基微滴(di)混合，使細(xi)胞均(jun)勻(yun)分(fen)布在微滴(di)中。油(you)基微滴(di)的大(da)小通(tong)常(chang)在幾百微(wei)米左(zuo)右(you)，這樣(yang)可以(yi)確保(bao)每(mei)個微滴中只包(bao)含壹個細胞。將(jiang)單細(xi)胞包(bao)裹到油基微滴(di)中後(hou)，細(xi)胞(bao)會(hui)在微滴(di)中生(sheng)長，並表(biao)達感興趣(qu)的(de)基因(yin)。

2. 基於FRET信(xin)號分(fen)選高產(chan)克隆(long)

基於FRET信(xin)號分(fen)選高產(chan)克隆(long)是(shi)利用熒(ying)光(guang)共振能量(liang)轉(zhuan)移(yi)（FRET）技術(shu)來(lai)篩選高產(chan)克隆(long)。FRET是(shi)壹種(zhong)熒(ying)光(guang)信(xin)號的(de)傳遞方式，當(dang)兩個熒(ying)光(guang)團(tuan)距離足夠(gou)近時，能量(liang)可以(yi)從發(fa)射(she)能量(liang)高的(de)熒(ying)光(guang)團(tuan)轉(zhuan)移(yi)到發射(she)能量(liang)低的熒(ying)光(guang)團(tuan)。在單細(xi)胞克隆(long)篩選中，通(tong)常(chang)將(jiang)壹個熒(ying)光(guang)團(tuan)標記在感興趣(qu)的(de)基因(yin)上(shang)，另(ling)壹個熒(ying)光(guang)團(tuan)標記在細胞(bao)的(de)表面(mian)或(huo)內(nei)部。當(dang)兩個熒(ying)光(guang)團(tuan)距離足夠(gou)近時，FRET信號會(hui)被檢(jian)測(ce)到。通(tong)過(guo)檢測(ce)FRET信號，可(ke)以(yi)篩選出(chu)高(gao)產(chan)克隆(long)。

3. 使用(yong)Cell Metric進行(xing)成(cheng)像(xiang)以(yi)驗(yan)證(zheng)單克隆(long)源(yuan)性

使用(yong)Cell Metric高分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)進行(xing)成(cheng)像(xiang)以(yi)驗(yan)證(zheng)單克隆(long)源(yuan)性。Cell Metric成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)提供(gong)超(chao)高分(fen)辨(bian)率(lv)成(cheng)像(xiang)，達到2um/像素(su)，能夠清(qing)晰展(zhan)示(shi)細(xi)胞細(xi)節(jie)，確保(bao)成(cheng)像(xiang)質(zhi)量(liang)。激光(guang)對(dui)焦技術(shu)確(que)保(bao)每(mei)個細胞孔(kong)都得(de)到準(zhun)確(que)成(cheng)像(xiang)，避(bi)免(mian)虛焦和遺(yi)漏微孔(kong)信息(xi)。

具(ju)體(ti)應用如(ru)下：

- Day 0細(xi)胞成(cheng)像(xiang)：在Day 0時，使用(yong)Cell Metric®對細(xi)胞(bao)板(ban)進(jin)行拍照(zhao)，記錄每個孔(kong)的細(xi)胞狀態(tai)。

- Day 1和Day 2細(xi)胞成(cheng)像(xiang)：在Day 1和Day 2時，再次使用(yong)Cell Metric成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)對細(xi)胞板(ban)進(jin)行拍照(zhao)，記錄每個孔(kong)的細(xi)胞分(fen)裂情(qing)況(kuang)。

- Day 7成(cheng)像(xiang)：在Day 7時，使用(yong)Cell Metric對細(xi)胞(bao)板(ban)進(jin)行拍照(zhao)，記錄每個孔(kong)的克隆(long)形(xing)成(cheng)情(qing)況(kuang)。

通(tong)過(guo)Cell Metric成(cheng)像(xiang)，可(ke)以(yi)確認約(yue)200-300個克隆(long)有(you)著高滴(di)度值，並(bing)選擇(ze)至少(shao)50個滴度MAX高的(de)單細(xi)胞擴(kuo)增(zeng)克隆(long)。這種(zhong)單細(xi)胞克隆(long)的(de)確認是(shi)非(fei)常(chang)嚴格(ge)的，並(bing)需要生(sheng)成(cheng)相(xiang)關(guan)報(bao)告(gao)用(yong)於提(ti)交IND。

 4. 克隆(long)擴(kuo)增(zeng)

使用(yong)先前(qian)同(tong)樣(yang)的方(fang)法，從靜(jing)態(tai)培養到搖瓶培養進行(xing)擴(kuo)增(zeng)。另(ling)用(yong)壹個30mL搖瓶補料(liao)分(fen)批培(pei)養(yang)，將(jiang)高表(biao)達克隆(long)繼(ji)續擴增(zeng)。

5. 克隆(long)評(ping)價(jia)

基於細(xi)胞生長和滴(di)度測(ce)試(shi)來(lai)最(zui)終確(que)定(ding)哪(na)些克隆(long)被(bei)送到生產(chan)部門(men)，並(bing)還(hai)需(xu)要將(jiang)細胞(bao)培(pei)養(yang)上清(qing)進行純(chun)化(hua)交到分(fen)析(xi)部門(men)，進(jin)行蛋(dan)白(bai)質量(liang)檢測(ce)——CE-SDS（毛細(xi)管電泳(yong)-SDS聚(ju)丙(bing)烯(xi)酰胺(an)凝(ning)膠電泳(yong)），HPLC-SEC（高(gao)效(xiao)液相(xiang)-尺(chi)寸(cun)排阻(zu)色(se)譜(pu)），CIEF（等(deng)電毛細(xi)聚(ju)焦），結合和功(gong)能測(ce)試(shi)。他(ta)們(men)同樣(yang)要檢(jian)測(ce)拷貝數，檢測(ce)支(zhi)原體。

 6. 產(chan)量(liang)分(fen)析(xi)

結果(guo)中挑(tiao)選了8個產(chan)量(liang)高的(de)克隆(long)送(song)去生產(chan)部門(men)，進(jin)行3L生(sheng)物反應器(qi)發酵，進行活(huo)細胞密(mi)度（VCD）和IgG產(chan)量(liang)分(fen)析(xi)。

 7. 產(chan)生(sheng)候(hou)選克隆(long)

將(jiang)品(pin)質較(jiao)高的候(hou)選克隆(long)被(bei)挑選出(chu)來(lai)，創建(jian)研究(jiu)細(xi)胞(bao)庫(ku)（RCB）。

通(tong)過(guo)Cell Metric高分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)，使FujiFilm Diosynth Biotechnologies公(gong)司(si)能夠快(kuai)速(su)、高(gao)效(xiao)地(di)篩選出(chu)高(gao)產(chan)單細(xi)胞克隆(long)，並(bing)保(bao)證(zheng)其高(gao)概率和高(gao)單克隆(long)源(yuan)性。這種(zhong)集成(cheng)化(hua)平臺能夠縮(suo)短(duan)細胞系(xi)開發時間，並(bing)提供(gong)高(gao)通(tong)量(liang)、快速(su)而溫和的(de)細胞包(bao)裹(guo)、靈敏(min)度高的定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)、單細(xi)胞克隆(long)衍(yan)生的視(shi)覺驗(yan)證(zheng)、高(gao)產(chan)單個細胞向微(wei)孔(kong)板(ban)中的(de)自(zi)動分(fen)配。

通(tong)過(guo)這個平臺，FujiFilm DDiosynth Biotechnologies公司(si)能夠更(geng)有效(xiao)地推(tui)動其生(sheng)物(wu)制(zhi)藥研發進(jin)程。Cell Metric®的高分(fen)辨(bian)率(lv)成(cheng)像(xiang)能力和對(dui)焦技術(shu)的(de)精(jing)確(que)性(xing)，使得(de)科學(xue)家能夠從大(da)量(liang)細胞(bao)中快(kuai)速(su)識別出(chu)單克隆(long)細(xi)胞，從而節(jie)省了時間和資(zi)源(yuan)。

Cell Metric細胞(bao)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)主要具(ju)有(you)以(yi)下特(te)點(dian)：

 1.實(shi)時監(jian)測(ce)和分(fen)析(xi)

Cell Metric配套(tao)軟(ruan)件允(yun)許(xu)科(ke)學家實(shi)時監(jian)控細(xi)胞(bao)在微池中的(de)生(sheng)長情況(kuang)，以(yi)及克隆(long)的(de)形(xing)成(cheng)和生(sheng)長情況(kuang)。這有助(zhu)於及(ji)時發現(xian)和排(pai)除不(bu)表達的細胞(bao)微(wei)池，提(ti)高篩選的準(zhun)確(que)性。同時，科學(xue)家可以(yi)利用軟(ruan)件中的(de)分(fen)析(xi)工具(ju)，對(dui)圖(tu)像(xiang)進行處(chu)理(li)和分(fen)析(xi)，以(yi)獲得(de)更(geng)多關(guan)於細(xi)胞生長和克隆(long)形(xing)成(cheng)的(de)信(xin)息(xi)。

2.自動化(hua)的數據(ju)記錄和報(bao)告(gao)功(gong)能

Cell Metric細胞(bao)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)能夠自(zi)動記錄每個孔(kong)的整(zheng)孔(kong)成(cheng)像(xiang)，包(bao)括(kuo)接種(zhong)細胞的具(ju)體(ti)位(wei)置(zhi)和細(xi)胞隨時間分(fen)裂和生(sheng)長的情(qing)況。這些數據(ju)可以(yi)被用(yong)於生(sheng)成(cheng)詳細的(de)單克隆(long)報(bao)告(gao)，記錄每個克隆(long)的(de)生長情況(kuang)，以(yi)及它(ta)們(men)的產(chan)量(liang)和表(biao)達水平。這些報(bao)告(gao)對(dui)於提(ti)交給(gei)監(jian)管機構(gou)來(lai)說是(shi)重要的(de)，因(yin)為它們(men)證(zheng)明(ming)了細(xi)胞(bao)系(xi)的(de)單克隆(long)源(yuan)性。

3.高(gao)效篩選和驗(yan)證(zheng)

通(tong)過(guo)結合(he)Cyto-Mine微流(liu)控(kong)單細(xi)胞分(fen)析(xi)篩選系(xi)統(tong)和Cell Metric高(gao)分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)，FujiFilm Diosynth Biotechnologies公司(si)能夠實(shi)現單細(xi)胞克隆(long)的(de)高效篩選和驗(yan)證(zheng)。這種(zhong)集成(cheng)化(hua)平臺能夠提(ti)供(gong)高通(tong)量(liang)、快速(su)而溫和的(de)細胞包(bao)裹(guo)、靈敏(min)度高的定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)、單細(xi)胞克隆(long)衍(yan)生的視(shi)覺驗(yan)證(zheng)、高(gao)產(chan)單個細胞向微(wei)孔(kong)板(ban)中的(de)自(zi)動分(fen)配。

4.質(zhi)量(liang)控制(zhi)和合(he)規性

Cell Metric系(xi)統(tong)能夠直接生成(cheng)單克隆(long)報(bao)告(gao)，滿(man)足政策(ce)法規中關(guan)於細(xi)胞單克隆(long)源(yuan)性的(de)要求(qiu)，並(bing)縮短篩選周期(qi)。高質量(liang)成(cheng)像(xiang)結(jie)果(guo)可以(yi)作(zuo)為證(zheng)據(ju)文(wen)件提交給(gei)監(jian)管部門(men)，用(yong)以(yi)證(zheng)明(ming)細(xi)胞(bao)系(xi)來(lai)源(yuan)於單個細胞祖先。

    總(zong)的(de)來(lai)說，Cell Metric高(gao)分(fen)辨(bian)率(lv)孔(kong)板(ban)成(cheng)像(xiang)系(xi)統(tong)及壹體(ti)化(hua)集成(cheng)平(ping)臺(tai)不(bu)僅提(ti)高(gao)了篩選的速(su)度(du)，還(hai)確(que)保(bao)了篩選的準(zhun)確(que)性，成(cheng)為生物(wu)制藥(yao)公(gong)司(si)的(de)新(xin)藥開發、抗體(ti)篩選等工(gong)藝生產(chan)的(de)重(zhong)要實(shi)驗(yan)室(shi)儀(yi)器(qi)設備(bei)。更(geng)多的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)儀(yi)器(qi)、實(shi)驗(yan)耗材(cai)、實(shi)驗(yan)試(shi)劑(ji)可以(yi)進入(ru)蘇(su)州阿爾法生物