利用Cell Metric單克隆(long)細胞追蹤成像系(xi)統(tong)加速抗(kang)體(ti)單克隆(long)細胞系(xi)的構建(jian)

在生物制(zhi)藥(yao)領域(yu)，單(dan)克隆(long)細胞系(xi)的構建(jian)是藥物研發的關(guan)鍵(jian)步(bu)驟(zhou)之(zhi)壹(yi)。SystImmune公(gong)司(si)，壹(yi)家專註於(yu)抗(kang)體研(yan)發的公(gong)司(si)，面(mian)臨(lin)著快(kuai)速構建(jian)高產量表達雙特異性抗(kang)體(ti)的單(dan)克隆(long)細胞系(xi)的挑戰(zhan)。為了應對這壹(yi)挑戰(zhan)， SystImmune采(cai)用了Cell Metric單克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)，提高了細胞系(xi)開發的效(xiao)率(lv)。 這裏詳細(xi)介紹(shao)SystImmune公(gong)司如何利用 Cell Metric ™系統(tong)加速雙特異性抗(kang)體(ti)單(dan)克隆(long)細胞系(xi)的構建(jian)。

SystImmune的細(xi)胞系(xi)開發流(liu)程

SystImmune使(shi)用(yong)CHOZN® (Sigma) 作(zuo)為表達平(ping)臺(tai)。CHOZN® GS-/- CHO細(xi)胞系(xi)是壹(yi)種(zhong)內源性谷(gu)氨(an)酰(xian)胺合成酶(mei)敲(qiao)除細胞株，為必需氨基酸(suan)谷氨(an)酰(xian)胺營(ying)養缺陷(xian)型，很容易(yi)據此來(lai)進(jin)行篩(shai)選(xuan)。

1.微池轉染和(he)挑選

CHOZN細(xi)胞被轉(zhuan)染進(jin)感興(xing)趣(qu)的基(ji)因，每孔(kong)鋪5000-10000細胞。由(you)於(yu)采(cai)用了CHOZN系統(tong)，回(hui)收率(lv)很高，例如接(jie)種(zhong)2-5板，回(hui)收率(lv)可(ke)達(da)約80%。到(dao)第14天(tian)時孔中(zhong)會有大量多(duo)克隆(long)細胞。由(you)於(yu)擴(kuo)增所有(you)微池是很困難(nan)的，因此會(hui)進(jin)行滴度測定來排(pai)除不(bu)表達的細(xi)胞微池。

2.微池的擴(kuo)增和(he)篩(shai)選(xuan)

產物表達最(zui)高的50個微池會選(xuan)來擴(kuo)增（通(tong)過(guo)靜態培(pei)養和(he)搖(yao)瓶），篩(shai)選(xuan)並做滴度測定。靜態擴(kuo)增包括(kuo)將微池細胞從(cong)96孔(kong)轉(zhuan)至(zhi)24孔板，然(ran)後(hou)轉(zhuan)至T25和(he)T75瓶中(zhong)培養。搖瓶擴(kuo)增包括(kuo)將微池中(zhong)的細(xi)胞擴(kuo)增，後轉(zhuan)至30mL補料分(fen)批(pi)培養搖瓶中(zhong)。SystImmune要對30mL補料分(fen)批(pi)培養產物進(jin)行滴度測定，這樣(yang)做的原因是有時靜態擴(kuo)增的滴度數據同最(zui)終(zhong)生物反應(ying)器(qi)中(zhong)滴度數據並(bing)不(bu)壹(yi)致(zhi)。

3.微池細胞有(you)限(xian)稀釋(shi)

使(shi)用(yong)Cell Metric單(dan)克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)進(jin)行稀釋(shi)鋪板時，至少挑選3個微池，用40塊(kuai)96孔板進(jin)行有限(xian)稀釋(shi)操(cao)作(zuo)。先(xian)用0.3-1個細胞/孔(kong)進(jin)行鋪板，而(er)後(hou)選(xuan)擇了合適(shi)的的0.5個細胞/孔(kong)進(jin)行鋪板。

4.克隆(long)源性確(que)證(zheng)和(he)存(cun)檔

Solentim Cell Metric imager用於(yu)對(dui)40塊細(xi)胞板進(jin)行拍照(zhao)，分別追蹤其在Day 0, Day 1 和(he)Day 2的細(xi)胞分(fen)裂情(qing)況，並在Day 7拍照(zhao)顯示其克隆(long)形成情(qing)況。在此階(jie)段(duan)，SystImmune確(que)認了約200-300個克隆(long)有著(zhe)高滴度值(zhi)，但通(tong)常選擇(ze)至(zhi)少50個Cell Metric確認的滴度最高的單(dan)細(xi)胞擴(kuo)增克隆(long)。這種(zhong)單細胞克隆(long)的確(que)認是非(fei)常嚴(yan)格(ge)的，並(bing)需(xu)要(yao)生成相關報告用於(yu)提(ti)交(jiao)IND。

5.克隆(long)擴(kuo)增

先(xian)前步驟(zhou)中(zhong)選出的高表達克隆(long)（基於(yu)圖(tu)像和(he)滴度數據）用(yong)先(xian)前同樣(yang)的方(fang)法(fa)，從靜態培(pei)養到(dao)搖瓶培養進(jin)行擴(kuo)增。另用(yong)壹(yi)個30mL搖瓶補料分(fen)批(pi)培養，將高表達克隆(long)繼續擴(kuo)增。

6.克隆(long)評價(jia)

SystImmune基於(yu)細(xi)胞生長和(he)滴度測試(shi)來(lai)最(zui)終(zhong)確定哪些(xie)克隆(long)被送(song)到(dao)生產部門(men)，並(bing)還(hai)需要(yao)將(jiang)細胞培(pei)養(yang)上清進(jin)行純化(hua)交(jiao)到(dao)分析(xi)部門(men)，進(jin)行蛋白質(zhi)量檢(jian)測——CE-SDS（毛細(xi)管(guan)電(dian)泳-SDS聚(ju)丙烯(xi)酰(xian)胺凝(ning)膠電(dian)泳），HPLC-SEC（高效(xiao)液(ye)相-尺寸(cun)排(pai)阻色譜(pu)），CIEF（等電(dian)毛細(xi)聚(ju)焦(jiao)），結(jie)合和(he)功能測試(shi)。他(ta)們同樣(yang)要檢(jian)測拷貝(bei)數，檢(jian)測支原體。

7.批(pi)量擴(kuo)增生產

後(hou)來(lai)SystImmune挑選了8個產量較高的克隆(long)送去(qu)生產部門(men)，進(jin)行3L生物反應(ying)器(qi)發酵，進(jin)行活(huo)細(xi)胞密(mi)度（VCD）和(he)IgG產(chan)量分(fen)析(xi)。

8.產(chan)生候選(xuan)克隆(long)

將好(hao)的候(hou)選(xuan)克隆(long)被挑選出(chu)來，創建(jian)研究細(xi)胞庫（RCB）。

細(xi)胞系(xi)開發過(guo)程中(zhong)面臨(lin)的挑戰(zhan)

同其他(ta)公司的CLD部門(men)壹(yi)樣(yang)，SystImmune公司(si)在細胞系(xi)開發過(guo)程中(zhong)也面臨(lin)著壹(yi)些(xie)關(guan)鍵的問(wen)題(ti)：

l 細(xi)胞系(xi)開發過(guo)程中(zhong)多步驟(zhou)的復(fu)雜(za)性

l 部門(men)人(ren)手不(bu)夠

l 降低時間(jian)周期(qi)及(ji)成本

l 每個步驟(zhou)中(zhong)形成良(liang)好(hao)的規則(ze)

l 提交(jiao)IND申(shen)請時可(ke)以(yi)形成規範的文(wen)件(jian)

l 可(ke)以(yi)證(zheng)實細胞的克隆(long)源性

對(dui)於(yu)後(hou)面兩點(dian)，同其他(ta)公司壹(yi)樣(yang)，SystImmune公司(si)已經敏(min)銳地覺察(cha)到(dao)FDA對於(yu)細(xi)胞系(xi)單(dan)克隆(long)源性的要(yao)求，FDA的Sarah Kennett博(bo)士(shi)曾(zeng)做過(guo)“Establishing Clonal Cell Lines – A Regulatory Perspective’ presentation"的報告。裏面概(gai)述(shu)了ICH Q5D的條款"For recombinant products, the cell substrate is the transfected cell containing the desired sequences which has been cloned from a single cell progenitor"。

為細胞的克隆(long)源性存(cun)檔

SystImmune選(xuan)擇(ze)在細胞系(xi)的開發過(guo)程中(zhong)使(shi)用(yong)Solentim的Cell Metric CLD來(lai)為細胞的克隆(long)源性存(cun)檔。Cell Metric 單克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)  可(ke)以(yi)對(dui)細胞孔(kong)進(jin)行高銳利度的整(zheng)孔(kong)成像，提(ti)供(gong)Day 0時的細(xi)胞狀態(tai)，從(cong)而(er)為單克隆(long)源性提(ti)供(gong)關鍵(jian)證(zheng)據，因此只需要(yao)壹(yi)輪(lun)克隆(long)即可(ke)。

為了提供(gong)克隆(long)源性的證(zheng)據，SystImmune利用Cell Metric單克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)的配(pei)套軟件(jian)的“輸(shu)出(chu)克隆(long)報告"功能制(zhi)作(zuo)的報告文件。報告中(zhong)展(zhan)示(shi)了對所需要(yao)的細(xi)胞孔(kong)的整(zheng)孔(kong)成像，接(jie)種(zhong)細胞的具(ju)體(ti)位(wei)置，細(xi)胞如何隨(sui)時間(jian)逐漸分裂生長為壹(yi)個克隆(long)團(tuan)（此處(chu)僅(jin)顯示了Day0和(he)Day1）。同樣(yang)地，孔(kong)內同細(xi)胞形態相似的壹(yi)些(xie)碎(sui)片和(he)雜(za)質(zhi)也會(hui)被拍到(dao)。這些(xie)碎(sui)片或(huo)雜質(zhi)是不(bu)會隨(sui)著時間(jian)而(er)發生任何形態上的變(bian)化(hua)的，這也是證(zheng)明該克隆(long)團(tuan)為單克隆(long)的重(zhong)要(yao)基(ji)礎。

使(shi)用(yong)CHOZN平(ping)臺(tai)和(he)以(yi)前(qian)的兩輪(lun)有(you)限(xian)稀釋(shi)，SystImmune大概(gai)要(yao)用(yong)20周(zhou)的時間(jian)獲得壹(yi)個好(hao)的候(hou)選(xuan)細(xi)胞系(xi)交(jiao)給生產部門(men)，這是壹(yi)個非(fei)常耗時的過(guo)程，對於(yu)提(ti)交(jiao)壹(yi)個IND申(shen)請這是壹(yi)個重要(yao)的限(xian)速步(bu)驟(zhou)。

闡明細胞的單(dan)克隆(long)源性在政策(ce)法(fa)規層(ceng)面是非(fei)常重要(yao)的。SystImmune使(shi)用(yong)Cell Metric CLD能(neng)夠很好(hao)的捕(bu)獲細胞接(jie)種(zhong)，數量增長直至形成克隆(long)團(tuan)的圖(tu)像。

使(shi)用(yong)Cell Metric，SystImmune在細胞系(xi)建(jian)立(li)過(guo)程中(zhong)可(ke)以(yi)去(qu)掉(diao)壹(yi)輪(lun)的有(you)限(xian)稀釋(shi)，這意味(wei)著(zhe)可(ke)以(yi)節(jie)省6-8周(zhou)的時間(jian)仍能夠達到(dao)法(fa)規的要(yao)求。通(tong)過(guo)這種(zhong)方式(shi)，SystImmune不(bu)僅(jin)加快(kuai)了細胞系(xi)的開發速度，還(hai)確保(bao)了細胞系(xi)單(dan)克隆(long)源性的合規性，這對於(yu)IND申(shen)請的提(ti)交(jiao)至關(guan)重(zhong)要(yao)。

SystImmune的這個案例充分展(zhan)示(shi)了Cell Metric單克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)在生物制(zhi)藥(yao)研(yan)發中(zhong)的巨大價(jia)值(zhi)。通(tong)過(guo)提高細胞系(xi)開發的效(xiao)率(lv)和(he)確(que)保單(dan)克隆(long)源性，Cell Metric為生物制(zhi)藥(yao)公(gong)司(si)提供(gong)了加速藥(yao)物上市的關(guan)鍵(jian)工具(ju)。這不(bu)僅(jin)縮短(duan)了研發周期(qi)，還(hai)能在確保(bao)產(chan)品質(zhi)量和(he)合規性的同時，降低(di)研(yan)發成本(ben)。

蘇(su)州阿(e)爾法(fa)生物的STUDIUS生態系(xi)統(tong)，通(tong)過(guo)整(zheng)合VIPS PRO單細(xi)胞鋪板、Cell Metric單(dan)克隆(long)細胞追蹤成像儀(yi)以(yi)及(ji)ICON細胞成(cheng)像系(xi)統(tong)，進(jin)行 IgG產率(lv)評(ping)估，為細胞株構建(jian)提供(gong)了壹(yi)個高效(xiao)的壹(yi)體(ti)化(hua)解決方(fang)案。這個軟件(jian)平(ping)臺(tai)允(yun)許科學(xue)家根(gen)據(ju)特定參(can)數自(zi)定義分析(xi)，並(bing)自(zi)動、即時地處(chu)理(li)數(shu)據，縮(suo)短(duan)了克隆(long)排(pai)名和(he)選(xuan)擇所(suo)需(xu)的時間(jian)。這些(xie) 實驗室(shi)儀器(qi)的使(shi)用(yong)不(bu)僅(jin)提高了細胞株構建(jian)的效(xiao)率(lv)和(he)精確性，還(hai)幫助(zhu)科學(xue)家加速了整(zheng)個細胞開發過(guo)程。