蛋(dan)白純化標(biao)簽(qian)選(xuan)購(gou)技巧

體外重組(zu)蛋(dan)白表(biao)達技術已經滲(shen)透(tou)到生物(wu)學(xue)的各(ge)個領域(yu)。目(mu)前，體外重組(zu)蛋(dan)白表(biao)達系(xi)統(tong)主要有(you)四(si)類：原核(he)表達(da)系(xi)統(tong)、哺(bu)乳(ru)動物(wu)細(xi)胞表(biao)達(da)、酵(jiao)母表(biao)達(da)系(xi)統(tong)及昆蟲(chong)細(xi)胞表(biao)達(da)。表(biao)達的(de)壹(yi)般實(shi)驗(yan)包括(kuo)載體構(gou)建(jian)-表達(da)鑒定(ding)-蛋白純化三大步(bu)驟(zhou)。在構(gou)建(jian)載體階段(duan)，除了壹(yi)些(xie)必要的(de)表(biao)達元件，還需要(yao)考(kao)慮的(de)密(mi)碼子(zi)優(you)化和(he)標(biao)簽(qian)的選(xuan)擇(ze)。選(xuan)擇(ze)合(he)適(shi)的標簽(qian)不(bu)但有(you)利於(yu)蛋(dan)白的純化，促進(jin)蛋(dan)白(bai)的(de)可溶性，同時(shi)也(ye)不(bu)能(neng)影(ying)響(xiang)蛋(dan)白(bai)的結(jie)構(gou)功能(neng)和下(xia)遊應(ying)用。本文詳(xiang)細(xi)介紹(shao)了(le)幾(ji)種蛋(dan)白(bai)純化標(biao)簽(qian)，幫助(zhu)我(wo)們更(geng)好的設(she)計實(shi)驗(yan)。

壹(yi)，蛋(dan)白純化標(biao)簽(qian)比較

二，HIS-Tag（組(zu)氨(an)酸標(biao)簽(qian)）

His標簽(qian)主要用來融合(he)表(biao)達的，其(qi)原因(yin)主要有(you)：

1，HIS-Tag本身(shen)的(de)特(te)性對(dui)目(mu)的蛋(dan)白(bai)沒有(you)影(ying)響(xiang)，不(bu)會形成二聚體；

2，分子(zi)量較小(xiao)，只(zhi)有0.84KD，對(dui)蛋(dan)白的下遊(you)應(ying)用不(bu)會產(chan)生影(ying)響(xiang)；

3，免(mian)疫原(yuan)性低(di)，可將(jiang)純化的(de)蛋(dan)白直(zhi)接註射(she)動(dong)物進(jin)行(xing)免(mian)疫並制備抗(kang)體；

4，HIS-Tag與細(xi)菌(jun)的(de)轉錄翻(fan)譯機(ji)制兼容，有(you)利於(yu)蛋(dan)白表達；

5，可與其(qi)他標(biao)簽(qian)構(gou)建(jian)雙標簽(qian)表達，可(ke)用於多(duo)種蛋(dan)白(bai)表(biao)達(da)系(xi)統(tong)，純化條(tiao)件(jian)溫和(he)對(dui)蛋(dan)白影(ying)響(xiang)較(jiao)小(xiao)。

HIS-Tag由6-10個組(zu)氨(an)酸殘(can)基(ji)組(zu)成，分子(zi)量不(bu)到0.84KD，通(tong)常(chang)插入在(zai)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)C末(mo)端(duan)或(huo)N末(mo)端(duan)。HIS-Tag是目(mu)前原(yuan)核(he)表(biao)達常(chang)用的標簽(qian)，蛋白純化完(wan)之後可(ke)以(yi)不(bu)需切(qie)除此標簽(qian)，也(ye)不(bu)會對(dui)蛋(dan)白產(chan)生功能(neng)影(ying)響(xiang)。同時(shi)，蛋白純化步(bu)驟(zhou)簡便(bian)，純化條(tiao)件(jian)溫和(he)，對(dui)蛋(dan)白也(ye)不(bu)會產(chan)生太大影(ying)響(xiang)。

三，GST-Tag（谷胱(guang)甘肽巰(qiu)基(ji)轉移酶(mei)標(biao)簽(qian)）

GST-Tag相(xiang)對(dui)分(fen)子(zi)質(zhi)量較大(da)，約為26KD，插入在(zai)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)C末(mo)端(duan)或(huo)N末(mo)端(duan)，大腸(chang)桿(gan)菌(jun)中常(chang)用在N端(duan)。GST(谷胱(guang)甘肽巰(qiu)基(ji)轉移酶(mei)) 蛋(dan)白本身(shen)是(shi)壹(yi)個在(zai)解(jie)毒(du)過(guo)程(cheng)中(zhong)起(qi)到重要作(zuo)用的轉移酶(mei)。壹(yi)般選(xuan)擇(ze)GST標(biao)簽(qian)的目(mu)的有(you)兩(liang)個，壹(yi)是(shi)提高蛋(dan)白(bai)表達的(de)可(ke)溶性，二(er)是提(ti)高(gao)蛋(dan)白的表達(da)量。蛋白(bai)表(biao)達純化結(jie)束後需(xu)根(gen)據(ju)不(bu)同的(de)蛋白應(ying)用而確定是(shi)否(fou)切(qie)除標簽(qian)，標簽(qian)較大，切(qie)除與否(fou)需(xu)根(gen)據(ju)下(xia)遊應(ying)用考慮。如果(guo)要去(qu)除GST融合部分，可用位點特(te)異性蛋(dan)白酶(mei)切(qie)除。檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)可用GST抗(kang)體或(huo)表(biao)達(da)的(de)目(mu)的蛋(dan)白(bai)特(te)異性抗(kang)體檢(jian)測(ce)。

GST-Tag的(de)優(you)缺(que)點

1，增(zeng)加(jia)外源(yuan)蛋白(bai)的可(ke)溶性；

2，可(ke)在不(bu)同的(de)宿主中表(biao)達(da)，適用範(fan)圍廣(guang)；

3，可(ke)用不(bu)同的(de)蛋白酶(mei)可(ke)以(yi)方便(bian)去(qu)除；

4，很好保留(liu)了(le)蛋白(bai)的抗(kang)原性和(he)生物(wu)活(huo)性，提(ti)高外(wai)原(yuan)蛋(dan)白的穩定性；

5，高(gao)特(te)異性，純化方(fang)便(bian)且溫(wen)和；

6，分(fen)子(zi)量較大(da)，可(ke)能(neng)會影(ying)響(xiang)蛋(dan)白(bai)質的(de)功能(neng)和下(xia)遊實(shi)驗(yan)；

7，如果(guo)蛋白(bai)不(bu)可溶，很難用變(bian)性的(de)方法(fa)純化。

GST親(qin)和(he)純化原(yuan)理(li)

GST 親(qin)和(he)層析^[1] 是(shi)利用GST 融合蛋白(bai)與固(gu)定(ding)的(de)谷胱(guang)甘肽(GSH)通(tong)過(guo)硫(liu)鍵共(gong)價(jia)親和(he)，通過(guo)GSH交(jiao)換(huan)洗脫(tuo)的原理(li)來進(jin)行(xing)純化 。該(gai)純化柱(zhu)中(zhong)，凝膠手(shou)臂上(shang)通(tong)過(guo)硫(liu)鍵結(jie)合壹(yi)個谷(gu)胱(guang)甘肽。然(ran)後利用谷胱甘肽與谷(gu)胱(guang)甘肽巰(qiu)基(ji)轉移酶(mei)（即GST-tag（26 KDa））之間(jian)酶(mei)和(he)底物(wu)的(de)特(te)異性作(zuo)用力，使得(de)帶GST標(biao)簽(qian)的融合(he)蛋白能(neng)夠與凝(ning)膠上(shang)的(de)手(shou)臂谷胱(guang)甘肽結(jie)合，從而將(jiang)帶標(biao)簽(qian)的蛋白(bai)與其(qi)他蛋(dan)白(bai)分(fen)離(li)開(kai)。谷(gu)胱(guang)甘肽通(tong)常(chang)有氧(yang)化型(xing)GSSG和(he)還原(yuan)型GSH，當(dang)我們使用GSH洗脫(tuo)時，GSH會與凝(ning)膠上(shang)的(de)谷(gu)胱(guang)甘肽競(jing)爭結(jie)合融合蛋(dan)白，從(cong)而(er)將目(mu)標蛋(dan)白(bai)洗(xi)脫(tuo)。GST標簽(qian)蛋白可(ke)直接從細(xi)菌(jun)裂解(jie)液中(zhong)利用含(han)有(you)還(hai)原型(xing)谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione sepharose)親和(he)樹(shu)脂進(jin)行(xing)純化。GST標(biao)簽(qian)蛋白可(ke)在溫和(he)、非(fei)變(bian)性條(tiao)件下(xia)洗(xi)脫(tuo)，因此保留(liu)了(le)蛋白(bai)的抗(kang)原性和(he)生物(wu)活(huo)性。GST在(zai)變(bian)性條(tiao)件下(xia)會失去對(dui)谷(gu)胱甘肽樹(shu)脂的(de)結(jie)合能(neng)力，因(yin)此不(bu)能(neng)在純化緩(huan)沖(chong)液中(zhong)加(jia)入(ru)強(qiang)變(bian)性劑(ji)如：鹽(yan)酸胍(gua)或(huo)尿(niao)素(su)等(deng)。如果(guo)蛋白(bai)表達(da)在包涵體中，可(ke)復性後(hou)再純化。此外要去除GST標簽(qian)，可用位點特(te)異性蛋(dan)白酶(mei)切(qie)除。

四，MBP-Tag（麥芽(ya)糖結(jie)合蛋白標(biao)簽(qian)）

MBP（麥芽(ya)糖結(jie)合蛋白maltose binding protein）， 殘(can)基(ji)數346，分子(zi)量42.5KDa，由大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)K12的malE基(ji)因(yin)編碼，構(gou)建(jian)時刻放在N端(duan)，用來提高(gao)可(ke)溶性（尤其(qi)是真核(he)蛋(dan)白）。MBP的(de)折(zhe)疊(die)需要(yao)DnaK-DnaJ-GrpE和GroEL-GeoES兩個分(fen)子(zi)伴(ban)侶(lv)系(xi)統(tong)的幫助(zhu)，這(zhe)可(ke)以(yi)使這(zhe)些(xie)分子(zi)伴(ban)侶(lv)聚(ju)集到目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)附近幫助(zhu)其(qi)正確(que)折(zhe)疊(die)。另(ling)外，以(yi)標簽(qian)蛋白形(xing)式存在(zai)的麥芽(ya)糖結(jie)合蛋白可(ke)以(yi)減少(shao)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)降(jiang)解(jie)，提(ti)高(gao)表(biao)達產(chan)物(wu)的水(shui)溶性，也(ye)為以(yi)後對(dui)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)純化提(ti)供(gong)了基(ji)礎。麥芽(ya)糖結(jie)合蛋白能(neng)夠被(bei)多(duo)糖樹(shu)脂吸(xi)附，因此在過(guo)柱(zhu)時(shi)，能(neng)夠使融合(he)蛋(dan)白與其(qi)它蛋(dan)白成份分離(li)。

MBP標簽(qian)的優(you)缺(que)點：

1，簡(jian)單(dan)親和純化即可實(shi)現(xian)；

2，增加(jia)蛋白(bai)表達量和蛋(dan)白(bai)穩定性；

3，促進(jin)蛋(dan)白(bai)的(de)可溶性和(he)正確(que)折(zhe)疊(die)；

4，標簽(qian)較大，對(dui)蛋(dan)白的結(jie)構(gou)/功能(neng)會有壹(yi)定(ding)影(ying)響(xiang)。

五(wu)，NusA-Tag（轉錄終止(zhi)/抗(kang)終止(zhi)蛋白標簽(qian)）

NusA是大腸(chang)桿(gan)菌(jun)自(zi)身(shen)的(de)壹(yi)種蛋(dan)白(bai)，即轉錄抗(kang)終止(zhi)因子(zi)，殘(can)基(ji)數,495，分子(zi)量:54.87KDa，由1999年(nian)Davia將(jiang)NusA從4000種大(da)腸(chang)桿(gan)菌(jun)蛋白庫中(zhong)篩(shai)得(de)。NusA不(bu)具有(you)獨立(li)的(de)純化標(biao)簽(qian)功能(neng)，所以(yi)要與其(qi)它標(biao)簽(qian)(如His標簽(qian))聯用。利用原核表達(da)時(shi)，NusA標(biao)簽(qian)可以(yi)明顯(xian)的(de)提(ti)高蛋白的可溶性，例(li)如含(han)有(you)NusA標(biao)簽(qian)的人白介素(su)-3 融(rong)合蛋(dan)白(NusA/hIL-3 )在37℃條件下(xia)誘導(dao)表達(da)幾(ji)乎全(quan)部(bu)可溶(97%)，而當(dang)其(qi)單獨表(biao)達(da)或(huo)融(rong)合(he)GST標(biao)簽(qian)表達時(shi)都(dou)是包涵(han)體形式(shi)。另(ling)外NusA標(biao)簽(qian)還可以(yi)提高(gao)不(bu)溶性靶(ba)蛋白(bai)如牛生長激(ji)素（bGH)、人幹擾(rao)素-γ (hIFN-γ)的(de)可(ke)溶性。來自(zi)草木(mu)犀(xi)根(gen)瘤菌(Rizobiummeliloti)的(de)酪氨酸激(ji)酶(mei)因(yin)為分子(zi)量大(超(chao)過(guo)54kDa)並且基(ji)因(yin)含(han)有(you)大(da)量稀有(you)密(mi)碼子(zi)，自(zi)身(shen)在(zai)大腸(chang)桿(gan)菌(jun)中無法過(guo)量表達(da)，但是(shi)與NusA融(rong)合(he)後(hou)卻可(ke)以(yi)高效(xiao)表(biao)達。

NusA的(de)優(you)缺(que)點：

1，可(ke)以(yi)提高(gao)蛋(dan)白質(zhi)的溶解性，可(ke)選(xuan)的(de)標(biao)簽(qian)有NusA，MBP，GST；

2，這(zhe)些(xie)標簽(qian)不(bu)能(neng)用專門的親(qin)和(he)基(ji)質(zhi)純化，融(rong)合(he)蛋白(bai)構(gou)建(jian)時必(bi)須(xu)與可(ke)用於純化的(de)小(xiao)親和(he)標簽(qian)連(lian)用。尤其(qi)是當(dang)NusA蛋白(bai)增加(jia)融合蛋白(bai)溶解性時(shi)，壹(yi)些(xie)在大腸(chang)桿(gan)菌(jun)中表達為(wei)不(bu)溶性的(de)蛋白(bai)在(zai)與NusA在(zai)N端(duan)融合(he)時(shi)則(ze)變(bian)成可溶。但是(shi)由於它的(de)分子(zi)量較大(da)，導(dao)致(zhi)靶(ba)蛋(dan)白(bai)的(de)得(de)率相(xiang)對(dui)降(jiang)低(di)；

3，NusA本身(shen)不(bu)具有(you)獨立(li)的(de)純化標(biao)簽(qian)功能(neng)，所以(yi)要與其(qi)它標(biao)簽(qian)如His標簽(qian)聯用；

4，NusA對(dui)蛋(dan)白下遊應(ying)用會有影(ying)響(xiang)，如蛋白需進(jin)行(xing)結(jie)構(gou)分(fen)析（晶(jing)體衍(yan)射(she)或(huo)核(he)磁共(gong)振(zhen)）。

六(liu)，SUMO（小(xiao)泛(fan)素(su)相(xiang)關修(xiu)飾物(wu)）

    SUMO標簽(qian)蛋白是(shi)壹(yi)種小(xiao)分(fen)子(zi)泛(fan)素(su)相(xiang)關修(xiu)飾蛋(dan)白，是(shi)存在於真核(he)生物(wu)中(zhong)高度保(bao)守(shou)的參(can)與蛋(dan)白(bai)質(zhi)小泛(fan)素(su)化相(xiang)關修(xiu)飾的(de)壹(yi)類(lei)大蛋白(bai)。與GST、MBP或(huo)NusA相(xiang)比，SUMO不(bu)僅可(ke)以(yi)作(zuo)為重組(zu)蛋(dan)白表(biao)達的(de)融(rong)合標簽(qian)還具備分子(zi)伴(ban)侶(lv)的(de)功能(neng)，能(neng)促進(jin)蛋(dan)白(bai)的(de)正確折(zhe)疊(die)，對(dui)熱(re)和蛋白酶(mei)具(ju)有耐受(shou)性，更(geng)有(you)助(zhu)於(yu)保(bao)持(chi)目(mu)的蛋(dan)白(bai)的(de)穩定性。此外，SUMO標簽(qian)有著與其(qi)配(pei)套的蛋(dan)白(bai)酶(mei)（專壹(yi)性強(qiang)），此蛋白酶(mei)識(shi)別(bie)的是(shi)SUMO的(de)三級結(jie)構(gou)，切(qie)割(ge)的(de)特(te)異性高(gao)，不(bu)存在(zai)任何氨基(ji)酸(suan)的殘留(liu)，因(yin)此適用於重組(zu)蛋(dan)白表(biao)達。

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