細(xi)胞雕(diao)亡(wang)檢(jian)測及分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)檢(jian)測步(bu)驟

細(xi)胞雕(diao)亡(wang)檢(jian)測及分(fen)子(zi)生物(wu)學(xue)檢(jian)測步(bu)驟：

1、細(xi)胞DNA 含(han)量(liang)分(fen)布（ 由細(xi)胞DNA 降解方式(shi)檢(jian)測細(xi)胞雕(diao)亡(wang)） 

    收(shou)集(ji)已固(gu)定(ding)的(de)單細(xi)胞懸(xuan)液(ye)約 5× 105~1 × 106/ml；

    離(li)心除去(qu)固定(ding)液(ye)， 3ml PBS 重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞;

   使用低速離心(xin)機 1500rpm  離心， 5 分(fen)鐘 ，棄去 PBS；

   加 PI 染(ran)液 1ml，室溫避(bi)光(guang) 20 分(fen)鐘；

   調整(zheng)細(xi)胞濃度(du) 5× 105/ml；

   上(shang)機檢(jian)測。

2 、磷(lin)脂(zhi)酰絲氨(an)酸(suan)外翻(fan)分(fen)析檢(jian)測細(xi)胞雕(diao)亡(wang)

1)      常(chang) 規 制(zhi) 備(bei) 單 細(xi) 胞 懸(xuan) 液(ye) ,  用 PBS   洗 兩(liang) 次 .(  若 為(wei) 全 血(xue) 要 先 溶  血(xue)),取(qu)約(yue) 5× 106 個(ge)細(xi)胞，1500rpm 離心,棄上(shang)清,用 400μl 1 ×Binding Buffer 重(zhong)懸(xuan)；

2)   分(fen)成(cheng) a 、b 、c 、d 、e 五(wu)管(guan)，每(mei)管(guan)約 1× 106 個(ge)細(xi)胞

a)    陰性對照(zhao)，不(bu)加任何(he)試(shi)劑(ji)；

b)    陽(yang)性對照(zhao),加 2%多聚甲醛(quan)固(gu)定(ding) 30 分(fen)鐘,加 AnnexinV 5μl, 室溫 10min , 用 1 ×Binding Buffer 洗壹(yi)次,棄上(shang)清再加 190μl  緩(huan)沖(chong)液、10μl PI 避(bi)光(guang) 15 分(fen)鐘

c)    加 10μl PI，避(bi)光(guang)孵育 15 分(fen)鐘；

d)   加 5μl AnnexinV 液(ye)，室溫避(bi)光(guang)孵育 15min；

e)    加 10μl PI 和(he) 5μl AnnexinV 液(ye)，室溫避(bi)光(guang)孵育 5min；

3)   每(mei)管(guan)各加 400μl 1 ×Binding Buffer。

4)   上(shang)機檢(jian)測。

註(zhu)意 a.  操(cao)作(zuo)動(dong)作要盡(jin)量輕柔，勿(wu)用力吹(chui)打(da)細(xi)胞；

b.  操(cao)作(zuo)時註(zhu)意避(bi)光(guang)；

c.  反(fan)應完畢後(hou)盡(jin)快(kuai)檢(jian)測，最好在壹(yi)小(xiao)時內(nei)檢(jian)測。

3、用單克隆(long)抗(kang)體 APO2.7 檢(jian)測細(xi)胞雕(diao)亡(wang)

1)   放置(zhi) 0.5~1× 106 個(ge)細(xi)胞到試(shi)管(guan)中；

2)    室溫離(li)心 200g ，6min；

3)    棄(qi)上(shang)清 ，加入(ru) 100μl 冷的(de)（4℃ )在 PBSF 溶液(ye)中含(han) 100µg/ml  的(de) digitonnin，輕輕地(di)重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞，在冰(bing)上(shang)孵育 20min；

4)   加入(ru) 2ml 冷的(de)（4℃) PBSF 液，室溫離(li)心 200g ，6min；

5)    棄(qi)上(shang)清， 加入(ru) 20μl PE 標記(ji)的(de) Apo2.7  單(dan)克隆(long)抗(kang)體和(he) 80μl PBSF 液，用 vortex 輕輕震(zhen)蕩(dang)，室溫避(bi)光(guang)孵育 15 分(fen)鐘；

6)   加入(ru) 2ml PBSF 液(ye)，室溫離(li)心 200g ，6min；

7)    棄(qi)上(shang)清，加入(ru) 1ml PBSF 液(ye)重(zhong)懸(xuan)細(xi)胞；

8)   避(bi)光(guang)保(bao)存，直到流(liu)式(shi)細(xi)胞儀檢(jian)測。

PBSF：含(han) 2.5% FCS（v/v）和(he) 0.01%NaN3（w/v）的 PBS。

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