瓊脂(zhi)糖核(he)酸電(dian)泳(yong)介紹(shao)

瓊(qiong)脂(zhi)糖核(he)酸電(dian)泳(yong)步(bu)驟(zhou)

1.    用蒸餾(liu)水(shui)將(jiang)制膠模(mo)具(ju)和(he)梳(shu)子(zi)沖洗幹(gan)凈(jing)， 放(fang)在(zai)制膠平板上， 封(feng)閉模(mo)具(ju)邊(bian)緣， 架好(hao)梳(shu)子(zi)；

2.    根(gen)據欲分離 DNA 片(pian)段(duan)大(da)小(xiao)用凝膠緩(huan)沖液(ye)配制適(shi)宜(yi)濃(nong)度(du)的(de)瓊脂(zhi)糖凝(ning)膠：準(zhun)確 稱(cheng)量(liang)瓊(qiong)脂(zhi)糖幹(gan)粉， 加入(ru)到(dao)配膠用的(de)三角燒瓶內(nei)， 定量(liang)加(jia)入(ru)電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液(ye)（壹(yi)般

20~30 ml）；

3.    放(fang)入(ru)到(dao)微波爐(lu)內(nei)加(jia)熱熔化。冷卻片(pian)刻(ke)， 加入(ru)壹(yi)滴熒光染料(liao)，輕(qing)輕旋(xuan)轉以充分

混勻凝(ning)膠溶液(ye)，倒入(ru)電(dian)泳(yong)槽中，待(dai)其凝(ning)固；

4.    室溫(wen)下(xia) 30~45 分鐘(zhong)後凝(ning)膠全凝結， 小(xiao)心(xin)拔(ba)出梳(shu)子(zi)， 將(jiang)凝(ning)膠安(an)放(fang)在(zai)電(dian)泳(yong)槽內；

5.    向(xiang)電(dian)泳(yong)槽中倒入電(dian)泳(yong)緩(huan)沖液(ye)，其量(liang)以沒過膠面 1mm 為宜(yi)，如(ru)樣(yang)品孔內(nei)有氣(qi)

泡，應設(she)法除(chu)去；

6.    在(zai) DNA 樣(yang)品中加(jia)入 10×體(ti)積(ji)的(de)載樣(yang)緩(huan)沖液(ye)（loading buffer），混勻後，用槍(qiang)

將(jiang)樣品混合(he)液(ye)緩(huan)慢(man)加(jia)入(ru)被浸(jin)沒的(de)凝膠加樣孔(kong)內；

7.    接通電(dian)源， 紅(hong)色為(wei)正(zheng)極(ji)，黑(hei)色(se)為負(fu)極， 切(qie)記 DNA 樣品由負(fu)極往(wang)正(zheng)極(ji)泳(yong)動 (靠

近(jin)加樣(yang)孔(kong)的(de)壹(yi)端為負(fu))。壹(yi)般 60 ～ 100V 電(dian)壓(ya)，電(dian)泳(yong) 20 ～ 40min 即可(ke)；

8.    根(gen)據指示(shi)劑(ji)泳(yong)動的(de)位置，判斷(duan)是(shi)否終(zhong)止(zhi)電(dian)泳(yong)；

9.    電(dian)泳(yong)完畢(bi)， 關上電(dian)源， 在(zai)凝(ning)膠成像儀(yi)上觀察(cha)電(dian)泳(yong)帶及(ji)其位置，並(bing)與(yu)核(he)酸(suan)分子(zi)

量(liang)標(biao)準(zhun) Marker 比較(jiao)被擴(kuo)增(zeng)產物(wu)的(de)大(da)小(xiao)。

膠回收純化(hua) DNA

1.   瓊脂(zhi)糖電(dian)泳(yong)，將特(te)異(yi)電(dian)泳(yong)帶用刀切(qie)下(xia)放(fang)入(ru)到(dao) EP 管(guan)中，稱(cheng)瓊(qiong)脂(zhi)糖帶的(de)重量(liang)；

2.   按照每(mei) 100mg 加 400µl 的(de)量(liang)加(jia)入(ru)binding buffer，放(fang)入(ru)到(dao) EP 管(guan)振(zhen)蕩器中(zhong)，45℃ ~

55℃溫(wen)育振(zhen)蕩，直到(dao)所有的(de)瓊脂(zhi)糖都(dou)溶解(jie)（大(da)概要 5 分鐘(zhong) ）；

3.   取(qu)出(chu)純(chun)化(hua)柱， 將上述溶(rong)解(jie)液(ye)轉移(yi)至(zhi)柱中， 室溫(wen)下(xia)放(fang)置 2 分鐘(zhong)， 8,000rpm   離心(xin)

1 分鐘(zhong)，棄(qi) EP 管(guan)中的(de)液(ye)體，將(jiang)純(chun)化柱放(fang)回 EP 管(guan)中；

4.   加(jia) 500µl 的(de) wash buffer 至(zhi)柱中， 8,000rpm   離心(xin) 1 分鐘(zhong)。棄(qi)管(guan)中的(de)溶液(ye)；

5.   重復操(cao)作 4 步(bu)的(de)操作 1 次，最(zui)後將(jiang)純(chun)化柱放(fang)入(ru) EP 管(guan)中 10,000rpm  離心(xin) 30 秒，

除去痕量(liang)的(de) wash buffer；

6.   將(jiang)純(chun)化柱放(fang)入(ru)壹(yi)個新(xin)的(de) EP 管(guan)。加 30~40µl H2O 或者 elution buffer 至(zhi)純(chun)化(hua)柱膜 的(de)中央(yang)，在(zai)37℃或 50℃下(xia)放(fang)置 2 分鐘(zhong)， 10,000rpm 離心(xin) 1 分鐘(zhong)洗脫(tuo) DNA，將

EP 管(guan)中的(de) DNA 溶液(ye)放(fang)在(zai)-20℃保存。

7.   註： 若想要不電(dian)泳(yong)而(er)直接純化(hua) DNA 溶(rong)液(ye)， 只需(xu)要在(zai)第(di) 2 步(bu)中按(an) 100µl 液(ye)量(liang)加(jia) 400µl 的(de) binding buffer,其余的(de)步(bu)驟(zhou)不變。