使(shi)用(yong)PCR儀(yi)進行基因(yin)擴(kuo)增的實驗(yan)方法(fa)

實(shi)驗(yan)室常(chang)用(yong) DNA 聚合(he)酶(mei)有(you)三種：TaqTM ， EXTaqTM  和  Pyrobest TM DNA Polymerase。TaqTM 是壹(yi)般(ban)的 DNA 聚合(he)酶(mei)， 保真(zhen)性較差(cha) ， 但價(jia)錢(qian)便宜， 壹(yi)般(ban)用(yong)於(yu)基因(yin)表(biao)達的檢(jian)測等(deng)。TaKaRa EXTaqTM 是具有(you) Proofreading  活(huo)性的耐熱(re)性 DNA 聚合(he)酶(mei)， 具有(you)壹(yi)定(ding)的保真(zhen)性， 而且(qie)其(qi)擴(kuo)增得(de)到(dao)的 PCR 產物 3 ’ 端(duan)附(fu)有(you)壹(yi)個(ge) “A" 堿(jian)基 ，如(ru)果(guo)希(xi)望直接(jie)將產物克(ke)隆 到 T-vector 可以(yi)用此(ci)酶 。 Pyrobest TM DNA Polymerase 也(ye)是具有(you) Proofreading 活(huo)性的耐熱(re)性 DNA 聚合(he)酶(mei)， 其特(te)點(dian)是保真(zhen)性高(gao)，擴(kuo)增得(de)到(dao)的 PCR 產物為平(ping)滑末(mo)端(duan)。如(ru)果(guo)進行基因(yin)的擴(kuo)增請(qing)使(shi)用(yong)此(ci)酶。

1.   按下(xia)列(lie)組成(cheng)在 PCR 反(fan)應(ying)管中調(tiao)制(zhi)反(fan)應(ying)液(ye)：

TaKaRa TaqTM 或(huo) TaKaRa EXTaqTM 的配方

merase 的配方

① 反(fan)應(ying)總(zong)體(ti)積根據實(shi)際(ji)情況(kuang)進行調控，可以(yi)做(zuo) 20~50µl 以(yi)節(jie)約(yue)試劑(ji)；

② 將上表(biao)各(ge)成(cheng)分(fen)加入到 0.2ml 或(huo) 0.5ml 滅菌的 PCR 薄(bo)壁(bi)管中；

③ 如(ru)果(guo)不(bu)用 PCR 儀(yi)的加熱蓋，在(zai)反(fan)應(ying)混(hun)合(he)液(ye)的上層(ceng)加 30 ~50µl  的礦(kuang)物油(you)防(fang)止(zhi)樣(yang)品在(zai) PCR 的過程(cheng)中(zhong)蒸(zheng)發(fa)；

2.   按以(yi)下(xia)程(cheng)序(xu)進行 PCR 擴(kuo)增。

PCR 反(fan)應(ying)條(tiao)件視模(mo)板、引物等(deng)的結(jie)構(gou)條件不同(tong)而(er)各(ge)異(yi)， 在(zai)實際(ji)操作(zuo)中(zhong)需(xu)根據(ju)具體(ti)的情況(kuang)以(yi)及(ji) PCR 結(jie)果(guo)而(er)進行優化。

反(fan)應(ying)結(jie)束(shu)後，抽取(qu)擴(kuo)增樣(yang)品(pin) 5µl，用(yong)瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠(jiao)電(dian)泳(yong)分(fen)析(xi)擴(kuo)增結(jie)果(guo)，用(yong) DNA marker 判(pan)斷擴(kuo)增片(pian)段(duan)的大(da)小或(huo)冷凍保存(cun)，以(yi)備(bei)以(yi)後分(fen)析(xi)使(shi)用(yong)。

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