X-射(she)線(xian)衍(yan)射(she)法(fa)

X-射(she)線(xian)衍(yan)射(she)技(ji)術(shu)是(shi)鑒(jian)定蛋⽩質結構(gou)的(de)⾦標準。XRD可以實(shi)現較(jiao)⾼的(de)分辨(bian)率，通常可以達(da)到1到2埃。因(yin)此，它可以(yi)提供(gong)⾮常詳細的(de)原⼦級別的(de)結(jie)構(gou)信(xin)息。然⽽蛋⽩質晶體的(de)⽣⻓對(dui)XRD來(lai)說是(shi)⼀個很(hen)⼤的(de)挑(tiao)戰(zhan)，因(yin)為不是(shi)所(suo)有(you)蛋⽩質都能夠形(xing)成(cheng)⾼質量(liang)的(de)結(jie)晶。對於難以(yi)結(jie)晶的(de)蛋⽩質，獲得(de)合(he)適的(de)晶體可(ke)能需(xu)要(yao)花費⼤量(liang)時間和(he)努(nu)⼒。這也就是(shi)為什麽(me)當科學家(jia)解(jie)析出⼀個新(xin)的(de)蛋⽩質結構(gou)通常都可以(yi)發(fa)CNS的(de)原因(yin)。

蛋⽩質三維結(jie)構(gou)的(de)精度(du)通常⽤“分辨(bian)率"來(lai)表示(shi)，單位(wei)為埃（Å），分辨(bian)率衡量(liang)了衍射(she)圖(tu)像以及(ji)計算電(dian)⼦密度(du)圖(tu)時看(kan)到的(de)細(xi)節(jie)⽔平。如(ru)果(guo)晶體中(zhong)的(de)所(suo)有(you)蛋⽩質都以(yi)相(xiang)同(tong)的(de)⽅式排列(lie)，形(xing)成(cheng)⼀個晶體，那(na)麽(me)其(qi)中(zhong)所(suo)有(you)的(de)蛋⽩質分⼦都(dou)會(hui)以(yi)相(xiang)同(tong)的(de)⽅式散射(she)X-射(she)線(xian)，使衍(yan)射(she)圖(tu)能夠顯(xian)示(shi)出(chu)晶體的(de)精細(xi)細節(jie)。 另⼀⽅⾯，如(ru)果(guo)晶體中(zhong)的(de)蛋⽩質都略(lve)有不(bu)同(tong)，例如(ru)由於局部(bu)柔(rou)性或運動(dong)等產(chan)⽣了(le)結構(gou)差(cha)異，衍(yan)射(she)圖(tu)案(an)就不會(hui)包含(han)那(na)麽(me)多的(de)精細(xi)的(de)信(xin)息。分辨(bian)率值為1 Å左右的(de)結(jie)構(gou)屬於(yu)⾼分辨(bian)率結構(gou)，其晶體是(shi)⾼度(du)有序的(de)，因(yin)此很(hen)容(rong)易(yi)在電(dian)⼦密度(du)圖(tu)中(zhong)看到每個原⼦。⽽分辨(bian)率⼤於3 Å的(de)結(jie)構(gou)僅顯(xian)示(shi)蛋⽩質鏈的(de)基本(ben)輪廓(kuo)，原⼦的(de)位(wei)置只能通過推測得(de)知。不(bu)過，⼤多數由(you)XRD解(jie)析的(de)蛋⽩質結構(gou)都介於(yu)這兩(liang)極之間(jian)。

上圖(tu)為不同分辨(bian)率下的(de)myoglobin蛋⽩的(de)電(dian)⼦雲(yun)密度(du)圖(tu)，1.0 Å分辨(bian)率下的(de)原⼦位置清(qing)晰(xi)可辨(bian)； 2.0 Å分辨(bian)率下雖(sui)然(ran)每個原⼦的(de)位(wei)置已經(jing)⽆法清晰辨(bian)認，但(dan)氨(an)基酸(suan)殘(can)基整(zheng)體的(de)形(xing)狀(zhuang)仍(reng)然(ran)清(qing)晰(xi)， 可以⽐較(jiao)準確(que)地(di)確(que)定(ding)原⼦位置；當分辨(bian)率來(lai)到2.7 Å，氨(an)基酸(suan)殘(can)基的(de)形(xing)狀(zhuang)已經(jing)變得(de)模糊(hu)，準(zhun)確(que) 推(tui)斷(duan)原⼦位置具(ju)有(you)較⼤困(kun)難；對(dui)於(yu)3.0 Å分辨(bian)率的(de)結(jie)構(gou)，⼏乎(hu)⽆法(fa)從(cong)電(dian)⼦雲(yun)密度(du)圖(tu)辨(bian)認出(chu)殘(can)基 的(de)形(xing)狀(zhuang)，僅能看到(dao)此處(chu)有⼀個殘(can)基存在。讀(du)者(zhe)可點擊此處(chu)的(de)鏈(lian)接(jie)⾃⾏觀(guan)察不(bu)同分辨(bian)率下的(de)電(dian)⼦ 雲(yun)形(xing)狀(zhuang)：1A6M（1.0 Å）、106M（2.0 Å）、108M（2.7 Å）、1S0H（3.0 Å）。

核(he)磁共(gong)振技術

核(he)磁共(gong)振技術通過分析蛋⽩質樣品中(zhong)的(de)信(xin)號(hao)來(lai)解(jie)析蛋⽩質的(de)結(jie)構(gou)。需(xu)要(yao)利(li)⽤特(te)定的(de)同(tong)位(wei)素(su)標記(ji) ⽅法(fa)（如(ru)15N或13C標記(ji)）將(jiang)⽬標蛋⽩質中(zhong)的(de)⼀部(bu)分原⼦標記(ji)上，再通過2D相(xiang)關實(shi)驗（如(ru)1H[1]15N HSQC或1H-1H COSY）確(que)定(ding)原⼦間的(de)連接關系及(ji)三維空(kong)間(jian)排布。基於(yu)實(shi)驗測(ce)得(de)的(de)NMR數 據(ju)，使⽤計算⽅法和(he)算法(fa)對蛋⽩質的(de)結(jie)構(gou)進⾏計算和(he)模擬(ni)，如(ru)分⼦動(dong)⼒學模(mo)擬(ni)、模(mo)擬(ni)退(tui)⽕等得(de) 到蛋⽩質的(de)三(san)維結(jie)構(gou)模型(xing)。

NMR的(de)分辨(bian)率通常較低，且(qie)⼀般(ban)只能⽤來(lai)分析較⼩的(de)蛋⽩質⽚段的(de)結(jie)構(gou)，通過多次(ci)采(cai)樣來(lai)得(de) 到溶(rong)液中(zhong)蛋⽩質的(de)平均(jun)位置。然(ran)⽽，NMR對(dui)樣品的(de)要(yao)求較(jiao)為靈活，可以提(ti)供有(you)關蛋⽩質動(dong)態(tai) ⾏為、柔(rou)性區(qu)域和(he)構(gou)象(xiang)變化的(de)重(zhong)要信(xin)息。

冷(leng)凍電(dian)⼦顯微(wei)鏡技(ji)術(shu)

冷(leng)凍電(dian)⼦顯微(wei)鏡是(shi)近(jin)年來(lai)⾼速發(fa)展(zhan)的(de)技(ji)術(shu)，通過觀(guan)察蛋⽩質的(de)冷(leng)凍樣品中(zhong)的(de)電(dian)⼦顯微(wei)圖(tu)像來(lai)解(jie)析蛋⽩質的(de)結(jie)構(gou)。Cryo-EM技術(shu)不(bu)需(xu)要(yao)蛋⽩質結晶。相(xiang)反(fan)，它使⽤冷(leng)凍技(ji)術來(lai)固定(ding)溶(rong)液中(zhong)的(de)蛋⽩質構(gou)象(xiang)，從(cong)⽽可(ke)以(yi)研究⾮晶態(tai)或⽆規則(ze)結構(gou)的(de)蛋⽩質。在過去，Cryo-EM的(de)分辨(bian)率不怎(zen)麽(me)⾼，通常只能達(da)到⼏⼗埃，僅能分辨(bian)出蛋⽩質顆粒(li)的(de)⼤致輪(lun)廓(kuo)。2017年的(de)諾(nuo)⻉爾(er)化學獎(jiang)授(shou)予(yu)了Jacques Dubochet、Joachim Frank和(he)Richard Henderson三位(wei)科學家(jia)，他(ta)們三(san)者(zhe)的(de)⼯作(zuo)極⼤地(di)提(ti)⾼了(le)Cryo-EM技術(shu)獲得(de)的(de)蛋⽩質圖(tu)像分辨(bian)率。⽬前，Cryo-EM技(ji)術(shu)獲得(de)的(de)蛋⽩結構(gou)可達(da)到數埃的(de)分辨(bian)率，能夠⼤致看(kan)出分⼦的(de)輪(lun)廓(kuo)與肽(tai)鏈⾛向(xiang)。PDB數據(ju)庫(ku)中(zhong)使⽤Cryo-EM⽅法(fa)解(jie)析出的(de)分辨(bian)率最⾼的(de)蛋⽩質已經(jing)具有原⼦級的(de)精度(du)，分辨(bian)率達(da)到了1.15 Å（PDBID：7A6A），不過，這些(xie)⾼精度(du)的(de)結(jie)構(gou)僅占(zhan)極⼩的(de)⽐例，⼤部分結(jie)構(gou)的(de)精度(du)還(hai)處(chu)於3-5 Å的(de)中(zhong)等分辨(bian)率下。

由(you)於⽆需(xu)結(jie)晶，也不(bu)⽤解(jie)析復雜的(de)核(he)磁共(gong)振信(xin)號(hao)，Cryo-EM在⼤分⼦和(he)超(chao)⼤分⼦的(de)結(jie)構(gou)解(jie)析上⾮常(chang)有優(you)勢，如(ru)⼤蛋⽩質復合(he)物(wu)、膜(mo)蛋⽩和(he)病毒(du)等。此外，Cryo-EM還(hai)能夠提(ti)供(gong)動(dong)態(tai)過程的(de)信(xin)息，如(ru)蛋⽩質的(de)構(gou)象(xiang)變化。

微(wei)晶電(dian)⼦衍射(she)技(ji)術(shu)

除(chu)了以(yi)上提(ti)到的(de)三(san)種(zhong)技術(shu)外，近(jin)年來(lai)⼀種新(xin)的(de)結(jie)構(gou)解(jie)析⽅法——微(wei)晶電(dian)⼦衍射(she)（Micro-ED）——正⾼速發(fa)展(zhan)起來(lai)。該技(ji)術(shu)可以(yi)快速、⾼分辨(bian)率的(de)測(ce)定(ding)⼩分⼦化合(he)物(wu)和(he)⽣物(wu)⼤分⼦的(de)3D結(jie)構(gou)。其使⽤電(dian)⼦作(zuo)為⼊射(she)光(guang)束(shu)，在冷(leng)凍透(tou)射(she)電(dian)鏡（cryo-TEM）上獲得(de)電(dian)⼦衍射(she)數據(ju)。由(you)於Micro-ED采(cai)⽤電(dian)⼦⽽⾮光⼦作(zuo)為射(she)線(xian)，電(dian)⼦相(xiang)⽐光(guang)⼦擁有更短的(de)德(de)布羅意(yi)波(bo)⻓，因(yin)此其與物(wu)質作(zuo)⽤的(de)強度更強，能夠分析很(hen)⼩的(de)晶體並(bing)達(da)到很(hen)⾼的(de)分辨(bian)率。通常Micro-ED只需(xu)使⽤約(yue)100納⽶的(de)⼩晶體，在⼏分鐘(zhong)內就能完(wan)成數據(ju)采(cai)集。並(bing)且(qie)數據(ju)采(cai)集過程可以(yi)直接(jie)得(de)到電(dian)⼦的(de)相(xiang)位(wei)信(xin)息，⽽⽆需(xu)進(jin)⾏相(xiang)位(wei)重(zhong)建。數據(ju)處(chu)理(li)⽅⾯，采(cai)⽤常(chang)規的(de)XRD解(jie)析⼯具就能解(jie)析Micro-ED數據(ju)，這更近(jin)⼀步(bu)降(jiang)低了(le)其(qi)應(ying)⽤⻔檻(kan)。

    不過，Micro-ED並(bing)不(bu)太適合(he)⼤尺⼨蛋⽩的(de)結(jie)構(gou)解(jie)析，其更適⽤於(yu)解(jie)析短肽(tai)以及(ji)⼩分⼦化合(he)物(wu)。例如(ru)天(tian)然(ran)產(chan)物(wu)的(de)結(jie)構(gou)解(jie)析或藥(yao)品⽣產(chan)中(zhong)對API的(de)分析等。⾃2013年應⽤以(yi)來(lai)，已經(jing)有數百(bai)篇Micro-ED相(xiang)關的(de)論⽂發(fa)表。

更多蛋白質組(zu)學相(xiang)關設(she)備(bei)、實(shi)驗試(shi)劑、實(shi)驗耗(hao)材(cai)進入蘇(su)州(zhou)阿(e)爾(er)法生物(wu)進(jin)行(xing)了解(jie)。