PCR反(fan)應體(ti)系(xi)與(yu)反(fan)應條件

PCR反(fan)應體(ti)系(xi)與(yu)反(fan)應條件

PCR（聚合(he)酶鏈(lian)反(fan)應）在(zai)遺(yi)傳(chuan)學(xue)、生(sheng)物醫學(xue)和生(sheng)物工程等領域具有(you)廣泛(fan)的應(ying)用。PCR反(fan)應體(ti)系(xi)是(shi)指(zhi)所(suo)有反(fan)應組分(fen)的(de)配比(bi)和濃(nong)度(du)，而PCR反(fan)應條件則(ze)包括(kuo)溫(wen)度(du)、時間(jian)和(he)核酸擴增的循(xun)環數等因素(su)。正(zheng)確(que)選(xuan)擇和優(you)化(hua)PCR反(fan)應體(ti)系(xi)與(yu)反(fan)應條件，對(dui)於(yu)保(bao)證(zheng)PCR反(fan)應的高(gao)效和可靠具(ju)有(you)至(zhi)關重(zhong)要的(de)意(yi)義(yi)。在(zai)下(xia)文中，我(wo)們(men)將(jiang)詳(xiang)細探討PCR反(fan)應體(ti)系(xi)和(he)反(fan)應條件的重(zhong)要性(xing)，並介(jie)紹壹些(xie)常用的優(you)化(hua)策(ce)略。

壹、標準的PCR反(fan)應體(ti)系(xi)：

　　　　　　 10×擴增緩沖(chong)液 　 10ul

　　　　　　 4種dNTP混(hun)合物(wu) 　 各200umol/L

　　　　　　 引(yin)物 　　　　 　 各10～100pmol　

　　　　　　 模(mo)板(ban)DNA 　　　 　0.1～2ug　

　 　　　　　Taq DNA聚合(he)酶 　 2.5u　

　　　　　　 Mg2+　　　　　　 1.5mmol/L

　　　　　　 加雙或三蒸(zheng)水(shui)至(zhi) 　100ul

　　二、PCR反(fan)應五要(yao)素(su)： 參(can)加PCR反(fan)應的物(wu)質(zhi)主要有五(wu)種即(ji)引(yin)物、酶、dNTP、模(mo)板(ban)和Mg2+

　　引(yin)物： 引(yin)物是PCR特異(yi)性反(fan)應的關鍵，PCR 產(chan)物的(de)特異(yi)性取決於引(yin)物與模(mo)板(ban)DNA互(hu)補(bu)的程度(du)。理論(lun)上(shang)，只(zhi)要知道(dao)任(ren)何(he)壹段模(mo)板(ban)DNA序(xu)列， 就(jiu)能(neng)按(an)其(qi)設計(ji)互(hu)補(bu)的寡核(he)苷酸鏈(lian)做(zuo)引(yin)物，利(li)用PCR就可(ke)將(jiang)模(mo)板(ban)DNA在(zai)體(ti)外(wai)大量(liang)擴增。

設計(ji)引(yin)物應遵(zun)循(xun)以下原則(ze)：

①引(yin)物長度(du)： 15-30bp，常用為20bp左右。

②引(yin)物擴增跨度(du)： 以200-500bp為宜(yi)，特定條件下可擴增長至(zhi)10kb的片段。

③引(yin)物堿基：G+C含(han)量(liang)以40-60%為宜(yi)，G+C太少(shao)擴增效果不(bu)佳，G+C過多(duo)易出現(xian)非(fei)特異(yi)條帶(dai)。ATGC盡(jin)量(liang)隨機分(fen)布(bu)，避(bi)免5個以上(shang)的嘌(piao)呤或嘧(mi)啶核苷酸的(de)成串排列。

④避(bi)免引(yin)物內部(bu)出現(xian)二(er)級(ji)結構，避(bi)免兩(liang)條引(yin)物間互(hu)補(bu)，特別是(shi)3'端(duan)的(de)互(hu)補(bu)，否(fou)則(ze)會(hui)形成引(yin)物二聚(ju)體(ti)，產(chan)生(sheng)非特異(yi)的擴增條帶(dai)。

⑤引(yin)物3'端(duan)的(de)堿基，特別是(shi)最(zui)末及(ji)倒數(shu)第(di)二個堿基，應嚴(yan)格要(yao)求配(pei)對(dui)，以避(bi)免因末端(duan)堿基不(bu)配對(dui)而(er)導致PCR失敗(bai)。

⑥引(yin)物中有或能(neng)加(jia)上(shang)合適(shi)的酶(mei)切位點， 被擴增的靶序(xu)列最(zui)好(hao)有適(shi)宜的酶(mei)切位點， 這對(dui)酶(mei)切分(fen)析(xi)或分(fen)子(zi)克隆很有(you)好處(chu)。

⑦引(yin)物的特異(yi)性：引(yin)物應與(yu)核(he)酸序(xu)列數(shu)據(ju)庫的其(qi)它(ta)序(xu)列無(wu)明(ming)顯同(tong)源性。引(yin)物量(liang)： 每條引(yin)物的濃(nong)度(du)0.1～1umol或10～100pmol，以min引(yin)物量(liang)產(chan)生(sheng)所(suo)需要的(de)結果為好，引(yin)物濃度(du)偏(pian)高會(hui)引(yin)起(qi)錯(cuo)配(pei)和(he)非(fei)特異(yi)性擴增，且可(ke)增加引(yin)物之(zhi)間形成二聚(ju)體(ti)的機會(hui)。

　　酶及(ji)其濃(nong)度(du)　目前有(you)兩(liang)種(zhong)Taq DNA聚合(he)酶供應， 壹種是(shi)從棲熱水(shui)生(sheng)桿(gan)菌中提(ti)純(chun)的天(tian)然(ran)酶，另壹種為(wei)大腸(chang)菌合(he)成的基(ji)因工(gong)程酶(mei)。催(cui)化(hua)壹典(dian)型的PCR反(fan)應約需酶量(liang)2.5U(指總(zong)反(fan)應體(ti)積為(wei)100ul時)，濃度(du)過高可(ke)引(yin)起(qi)非(fei)特異(yi)性擴增，濃度(du)過低(di)則(ze)合成產(chan)物量(liang)減少(shao)。

　　dNTP的質(zhi)量(liang)與(yu)濃(nong)度(du)　dNTP的質(zhi)量(liang)與(yu)濃(nong)度(du)和PCR擴增效率有密切關系(xi)，dNTP粉呈顆(ke)粒狀，如(ru)保(bao)存(cun)不(bu)當易變性(xing)失去(qu)生(sheng)物學(xue)活性(xing)。dNTP溶(rong)液呈酸性(xing)，使(shi)用時應(ying)配成高濃(nong)度(du)後(hou)，以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩(huan)沖液(ye)將(jiang)其PH調(tiao)節(jie)到(dao)7.0～7.5，小量(liang)分(fen)裝， -20℃冰(bing)凍(dong)保(bao)存(cun)。多(duo)次(ci)凍(dong)融會(hui)使(shi)dNTP降(jiang)解。在(zai)PCR反(fan)應中，dNTP應為(wei)50～200umol/L，尤其(qi)是註意4種dNTP的濃(nong)度(du)要相(xiang)等( 等摩爾(er)配(pei)制(zhi))，如(ru)其(qi)中任(ren)何(he)壹種濃(nong)度(du)不(bu)同於(yu)其它(ta)幾(ji)種時(shi)(偏(pian)高或偏(pian)低(di))，就會(hui)引(yin)起(qi)錯(cuo)配(pei)。濃(nong)度(du)過低(di)又(you)會(hui)降(jiang)低(di)PCR產(chan)物的(de)產(chan)量(liang)。dNTP能與(yu)Mg2+結合，使(shi)遊離(li)的Mg2+濃度(du)降(jiang)低(di)。

　　模(mo)板(ban)(靶基因(yin))核酸　模(mo)板(ban)核酸的(de)量(liang)與(yu)純(chun)化(hua)程度(du)，是PCR成敗與(yu)否(fou)的(de)關鍵環(huan)節(jie)之(zhi)壹，傳(chuan)統的DNA純化(hua)方(fang)法(fa)通常采用SDS和蛋白酶K來消(xiao)化(hua)處(chu)理(li)標本。SDS的主要功能是： 溶(rong)解細胞膜上(shang)的脂類(lei)與蛋白質，因而(er)溶(rong)解膜蛋白而破壞細胞膜，並解離(li)細胞中的核(he)蛋白，SDS 還能(neng)與蛋白質結合而(er)沈澱(dian)； 蛋白酶K能水(shui)解消(xiao)化(hua)蛋白質，特別是(shi)與(yu)DNA結合的(de)組蛋白，再用有機溶(rong)劑(ji)酚與氯(lv)仿抽提(ti)掉蛋白質和其(qi)它(ta)細胞組份(fen)，用乙醇(chun)或異(yi)丙(bing)醇(chun)沈澱(dian)核酸。提(ti)取的核酸即(ji)可(ke)作(zuo)為模(mo)板(ban)用於PCR反(fan)應。壹般(ban)臨床檢測(ce)標本，可采用快速簡(jian)便(bian)的方(fang)法溶(rong)解細胞，裂解病(bing)原體(ti)，消(xiao)化(hua)除去(qu)染色(se)體(ti)的蛋白質使(shi)靶基因(yin)遊離(li)，直接用於PCR擴增。RNA模(mo)板(ban)提(ti)取壹般(ban)采用異(yi)硫(liu)氰(qing)酸胍(gua)或蛋白酶K法，要(yao)防(fang)止RNase降(jiang)解RNA。

　　Mg2+濃度(du)　Mg2+對(dui)PCR擴增的特異(yi)性和(he)產(chan)量(liang)有(you)顯著(zhu)的(de)影(ying)響(xiang)，在(zai)壹般(ban)的PCR反(fan)應中，各種dNTP濃度(du)為200umol/L時，Mg2+濃度(du)為1.5～2.0mmol/L為宜(yi)。Mg2+濃度(du)過高，反(fan)應特異(yi)性降(jiang)低(di)，出(chu)現(xian)非特異(yi)擴增，濃度(du)過低(di)會(hui)降(jiang)低(di)Taq DNA聚合(he)酶的(de)活性，使(shi)反(fan)應產(chan)物減少(shao)。

三、PCR反(fan)應條件的選(xuan)擇

　　PCR反(fan)應條件為溫(wen)度(du)、時間(jian)和(he)循環(huan)次(ci)數。

　　溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)的設置(zhi)： 基於(yu)PCR原理三步驟而設置(zhi)變性(xing)-退火(huo)-延(yan)伸三個溫(wen)度(du)點。在(zai)標準反(fan)應中采用三溫(wen)度(du)點法(fa)，雙鏈(lian)DNA在(zai)90～95℃變性(xing)，再迅速冷卻(que)至(zhi)40 ～60℃，引(yin)物退火(huo)並結合到(dao)靶序(xu)列上(shang)，然(ran)後(hou)快速升溫(wen)至(zhi)70～75℃，在(zai)Taq DNA 聚合(he)酶的(de)作(zuo)用下，使(shi)引(yin)物鏈(lian)沿(yan)模(mo)板(ban)延(yan)伸。對(dui)於(yu)較(jiao)短靶基因(yin)(長度(du)為100～300bp時)可采(cai)用二溫(wen)度(du)點法(fa)， 除變性(xing)溫(wen)度(du)外(wai)、退火(huo)與(yu)延(yan)伸溫(wen)度(du)可合(he)二(er)為壹，壹般(ban)采用94℃變性(xing)，65℃左右退(tui)火與(yu)延(yan)伸(此溫(wen)度(du)Taq DNA酶仍(reng)有較(jiao)高的催化(hua)活(huo)性(xing))。

　　①變性(xing)溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)：變性(xing)溫(wen)度(du)低(di)，解鏈(lian)不(bu)夠(gou)是(shi)導致PCR失敗(bai)的最(zui)主要原因。壹般(ban)情(qing)況(kuang)下，93℃～94℃min足(zu)以使(shi)模(mo)板(ban)DNA變性(xing)，若低(di)於(yu)93℃則(ze)需延(yan)長時間，但溫(wen)度(du)不(bu)能過高，因(yin)為(wei)高溫(wen)環(huan)境(jing)對(dui)酶(mei)的(de)活性(xing)有(you)影響(xiang)。此步(bu)若不(bu)能使(shi)靶基因(yin)模(mo)板(ban)或PCR產(chan)物變性(xing)，就會(hui)導致PCR失敗(bai)。

　　②退火(huo)(復性(xing))溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)：退火(huo)溫(wen)度(du)是影(ying)響(xiang)PCR特異(yi)性的(de)較(jiao)重(zhong)要因(yin)素(su)。變性(xing)後(hou)溫(wen)度(du)快速冷卻(que)至(zhi)40℃～60℃，可使(shi)引(yin)物和模(mo)板(ban)發生(sheng)結合。由(you)於模(mo)板(ban)DNA 比(bi)引(yin)物復雜得多(duo)，引(yin)物和模(mo)板(ban)之(zhi)間的碰(peng)撞(zhuang)結合機會(hui)遠遠(yuan)高(gao)於模(mo)板(ban)互(hu)補(bu)鏈(lian)之(zhi)間的碰(peng)撞(zhuang)。退(tui)火溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)，取決於引(yin)物的長(chang)度(du)、堿基組成及(ji)其濃(nong)度(du)，還有(you)靶基序(xu)列的(de)長(chang)度(du)。對(dui)於(yu)20個核(he)苷(gan)酸，G+C含(han)量(liang)約50%的引(yin)物，55℃為選(xuan)擇最適退火(huo)溫(wen)度(du)的起(qi)點(dian)較(jiao)為(wei)理(li)想。引(yin)物的復(fu)性(xing)溫(wen)度(du)可通過以下公(gong)式幫助(zhu)選(xuan)擇合適的溫(wen)度(du)：

　　　　　Tm值(解鏈(lian)溫(wen)度(du))=4(G+C)＋2(A+T)

　　　　　復性(xing)溫(wen)度(du)=Tm值-(5～10℃)

　　在(zai)Tm值允(yun)許(xu)範(fan)圍內， 選(xuan)擇較高的復(fu)性(xing)溫(wen)度(du)可大大減少(shao)引(yin)物和模(mo)板(ban)間的(de)非特異(yi)性結合， 提(ti)高(gao)PCR反(fan)應的特異(yi)性。復(fu)性(xing)時(shi)間壹般(ban)為30～60sec，足(zu)以使(shi)引(yin)物與模(mo)板(ban)之(zhi)間全結合。

　　③延(yan)伸溫(wen)度(du)與時(shi)間(jian)：Taq DNA聚合(he)酶的(de)生(sheng)物學(xue)活性(xing)：

　　　　　　　　　70～80℃ 150核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子(zi)

　　　　　　　　　70℃ 60核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子(zi)

　　　　　　　　　55℃ 24核苷(gan)酸/S/酶分(fen)子(zi)

　　　　　　　　　高於(yu)90℃時， DNA合成幾(ji)乎不(bu)能進(jin)行(xing)。

PCR反(fan)應的延(yan)伸溫(wen)度(du)壹般(ban)選(xuan)擇在(zai)70～75℃之(zhi)間，常用溫(wen)度(du)為72℃，過高的(de)延(yan)伸溫(wen)度(du)不(bu)利(li)於(yu)引(yin)物和模(mo)板(ban)的結合。PCR延(yan)伸反(fan)應的時(shi)間(jian)，可根據(ju)待擴增片段的(de)長度(du)而定(ding)，壹般(ban)1Kb以內的(de)DNA片段，延(yan)伸時間1min是足(zu)夠(gou) 的(de)。3～4kb的靶序(xu)列需3～4min；擴增10Kb需延(yan)伸至(zhi)15min。延(yan)伸進間過長會(hui)導致非特異(yi)性擴增帶的(de)出現。對(dui)低(di)濃(nong)度(du)模(mo)板(ban)的擴增，延(yan)伸時間要(yao)稍長些(xie)。

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