PCR實驗常見問題(ti)總匯

PCR產(chan)物的電泳(yong)檢(jian)測(ce)時間(jian)

　　壹般為48h以(yi)內，有些最(zui)好(hao)於當(dang)日電泳(yong)檢(jian)測(ce)，大(da)於48h後帶型(xing)不(bu)規則(ze)甚致消失(shi)。

假(jia)陰性，不(bu)出(chu)現擴(kuo)增(zeng)條(tiao)帶
　　PCR反(fan)應(ying)的(de)關(guan)鍵(jian)環(huan)節(jie)有

①模(mo)板(ban)核(he)酸的制(zhi)備(bei)

②引物的質(zhi)量(liang)與特(te)異性

③酶的(de)質量(liang)及 

④PCR循(xun)環(huan)條(tiao)件。

尋找原(yuan)因亦(yi)應(ying)針(zhen)對(dui)上(shang)述(shu)環(huan)節(jie)進行(xing)分析(xi)研(yan)究。
　　模(mo)板(ban)：

①模(mo)板(ban)中(zhong)含(han)有雜蛋(dan)白質(zhi)

②模(mo)板(ban)中(zhong)含(han)有Taq酶抑(yi)制(zhi)劑，

③模(mo)板(ban)中(zhong)蛋(dan)白質(zhi)沒(mei)有消 化除(chu)凈(jing)，特(te)別是(shi)染(ran)色(se)體中的(de)組(zu)蛋白，

④在(zai)提(ti)取(qu)制(zhi)備(bei)模(mo)板(ban)時丟失(shi)過(guo)多，或吸(xi)入(ru)酚。

⑤模(mo) 板(ban)核(he)酸變(bian)性不(bu)堅(jian)決。在酶和(he)引物質量(liang)好(hao)時，不(bu)出(chu)現擴(kuo)增(zeng)帶，極有可能是標(biao)本的(de)消(xiao)化處 理(li)，模(mo)板(ban)核(he)酸提取(qu)過程(cheng)出(chu)了(le)毛(mao)病，因而(er)要配(pei)制(zhi)有效而(er)穩定(ding)的(de)消(xiao)化處理(li)液，其程(cheng)序亦(yi)應(ying) 固(gu)定(ding)不(bu)宜隨(sui)意更(geng)改(gai)。
　　酶失(shi)活(huo)：

需(xu)更(geng)換新(xin)酶，或(huo)新(xin)舊兩種酶同(tong)時使(shi)用，以(yi)分析(xi)是(shi)否(fou)因酶的(de)活(huo)性喪(sang)失(shi)或(huo)不(bu)夠(gou)而(er) 導致假陰性。需(xu)註(zhu)意的是(shi)有時忘加Taq酶或(huo)溴乙(yi)錠。
　　引物：

引物質量(liang)、引物的濃(nong)度(du)、兩條引(yin)物的濃(nong)度(du)是否(fou)對(dui)稱(cheng)，是PCR失(shi)敗(bai)或(huo)擴(kuo)增(zeng)條(tiao)帶不(bu) 理(li)想、容(rong)易(yi)彌散(san)的常見原(yuan)因。有些批(pi)號的(de)引物合成(cheng)質(zhi)量(liang)有問題(ti)，兩條引(yin)物壹條濃(nong)度(du) 高，壹條濃(nong)度(du)低，造成(cheng)低效(xiao)率的(de)不(bu)對(dui)稱(cheng)擴(kuo)增(zeng)，

對(dui)策(ce)為(wei)：①選(xuan)定(ding)壹個(ge)好(hao)的引物合成(cheng)單(dan) 位(wei)。

②引物的濃(nong)度(du)不(bu)僅(jin)要看(kan)OD值(zhi)，更(geng)要註(zhu)重引(yin)物原(yuan)液做瓊脂糖凝膠(jiao)電泳(yong)，壹定(ding)要(yao)有引物條帶出(chu)現，而(er)且兩引物帶的亮度(du)應(ying)大(da)體壹致，如(ru)壹條引(yin)物有條帶，壹條引(yin)物無條(tiao)帶，此時做PCR有可能失(shi)敗(bai)，應(ying)和(he)引(yin)物合成(cheng)單(dan)位(wei)協(xie)商解(jie)決。如壹條引(yin)物亮度(du)高(gao)，壹條亮(liang)度(du)低，在稀釋引物時要平衡其濃(nong)度(du)。

③引(yin)物應(ying)高(gao)濃(nong)度(du)小量(liang)分裝(zhuang)保存(cun)，防止(zhi)多次(ci)凍融或長(chang)期放(fang)冰箱冷藏(zang)部(bu)分，導致引物變(bian)質降解失(shi)效(xiao)。

④引(yin)物設(she)計(ji)不(bu)合(he)理(li)，如引(yin)物長(chang)度不(bu)夠(gou)，引(yin)物之(zhi)間(jian)形成二(er)聚體等。
　　Mg2+濃(nong)度(du)：

Mg2+離(li)子(zi)濃度對(dui)PCR擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率影(ying)響(xiang)很(hen)大(da)，濃(nong)度過高(gao)可降(jiang)低(di)PCR擴(kuo)增(zeng)的(de)特(te) 異(yi)性，濃度(du)過低(di)則(ze)影響(xiang)PCR擴(kuo)增(zeng)產(chan)量(liang)甚至(zhi)使(shi)PCR擴(kuo)增(zeng)失(shi)敗(bai)而(er)不(bu)出(chu)擴(kuo)增(zeng)條(tiao)帶。
　　反(fan)應(ying)體積的(de)改(gai)變(bian)：

通(tong)常進行(xing)PCR擴(kuo)增(zeng)采(cai)用的體積為(wei)20ul、30ul、50ul。或(huo)100ul，應(ying)用多 大(da)體積進行(xing)PCR擴(kuo)增(zeng)，是(shi)根據科(ke)研(yan)和臨(lin)床檢(jian)測(ce)不(bu)同(tong)目(mu)的而(er)設(she)定(ding)，在(zai)做小體積如(ru)20ul 後(hou)，再做大(da)體積時，壹定(ding)要(yao)模(mo)索(suo)條(tiao)件(jian)，否(fou)則(ze)容易(yi)失(shi)敗(bai)。
　　物理(li)原(yuan)因：

變(bian)性對(dui)PCR擴(kuo)增(zeng)來說(shuo)相(xiang)當(dang)重要(yao)，如(ru)變(bian)性溫度低(di)，變(bian)性時間(jian)短，極有可能出(chu)現假陰性;退火溫度過(guo)低(di)，可(ke)致非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)而(er)降低(di)特(te)異性擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率退(tui)火溫度過(guo)高(gao)影(ying)響引(yin)物與模(mo)板(ban)的(de)結(jie)合而(er)降低(di)PCR擴(kuo)增(zeng)效(xiao)率。有時還有必要用標準(zhun)的(de)溫度計(ji)，檢(jian)測(ce)壹下(xia)擴(kuo)增(zeng)儀(yi)或(huo)水(shui)溶鍋(guo)內(nei)的(de)變(bian)性、退火和延伸溫度，這(zhe)也(ye)是(shi)PCR失(shi)敗(bai)的(de)原(yuan)因之(zhi)壹。
　　靶序列變(bian)異：

如靶序列發(fa)生突(tu)變(bian)或缺(que)失(shi)，影(ying)響(xiang)引物與模(mo)板(ban)特(te)異(yi)性結(jie)合，或(huo)因靶(ba)序列某 段(duan)缺(que)失(shi)使(shi)引(yin)物與模(mo)板(ban)失(shi)去(qu)互補序列，其PCR擴(kuo)增(zeng)是(shi)不(bu)會成功(gong)的。

假(jia)陽(yang)性
　　出(chu)現的PCR擴(kuo)增(zeng)條(tiao)帶與目的(de)靶(ba)序列條帶壹致，有時其條(tiao)帶更整齊(qi)，亮(liang)度(du)更高(gao)。
　　引(yin)物設(she)計(ji)不(bu)合(he)適(shi)：選(xuan)擇(ze)的擴(kuo)增(zeng)序列與非目的(de)擴(kuo)增(zeng)序列有同(tong)源(yuan)性，因而(er)在進行(xing)PCR擴(kuo)增(zeng)時，擴(kuo)增(zeng)出(chu)的(de)PCR產(chan)物為非目的(de)性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出(chu)現假陽(yang)性。需(xu)重新(xin)設(she)計(ji)引物。
　　靶序列或擴(kuo)增(zeng)產(chan)物的交(jiao)叉(cha)汙(wu)染(ran)：這(zhe)種(zhong)汙(wu)染(ran)有兩種原(yuan)因：壹是整(zheng)個(ge)基因組(zu)或(huo)大(da)片(pian)段(duan)的交叉(cha)汙(wu)染(ran)，導致假陽(yang)性。這(zhe)種(zhong)假(jia)陽(yang)性可用以(yi)下(xia)方法解決：操作(zuo)時應(ying)小(xiao)心(xin)輕(qing)柔，防止(zhi)將(jiang)靶(ba)序列吸入加樣(yang)槍內或(huo)濺(jian)出(chu)離(li)心(xin)管(guan)外。除(chu)酶及(ji)不(bu)能(neng)耐(nai)高(gao)溫的物質外，所有試劑或(huo)器材均(jun)應(ying)高(gao)壓(ya)消(xiao)毒。所用離(li)心(xin)管(guan)及(ji)樣(yang)進槍頭等均(jun)應(ying)壹次(ci)性使(shi)用。必要(yao)時，在加標(biao)本前(qian)，反(fan)應(ying)管(guan)和(he)試(shi)劑用紫外線(xian)照射，以(yi)破壞存在(zai)的核(he)酸。二(er)是(shi)空(kong)氣(qi)中的小片(pian)段(duan)核(he)酸汙(wu)染(ran)，這(zhe)些小片(pian)段(duan)比(bi)靶(ba)序列短，但有壹定(ding)的(de)同(tong)源(yuan)性。可互(hu)相(xiang)拼接(jie)，與(yu)引(yin)物互補後，可擴(kuo)增(zeng)出(chu)PCR產(chan)物，而(er)導致假陽(yang)性的產(chan)生，可用巢式(shi)PCR方法來減輕(qing)或(huo)消除(chu)。

出(chu)現非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)帶
　　PCR擴(kuo)增(zeng)後(hou)出(chu)現的條帶與預計(ji)的大(da)小(xiao)不(bu)壹致，或(huo)大(da)或(huo)小，或者(zhe)同(tong)時出(chu)現特異性擴(kuo)增(zeng)帶 與非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)帶。非特異(yi)性條帶的出(chu)現，其原(yuan)因：壹是引(yin)物與靶(ba)序列不(bu)互(hu)補、 或引物聚合形成二(er)聚體。二(er)是(shi)Mg2+離(li)子(zi)濃度過(guo)高、退(tui)火溫度過(guo)低(di)，及(ji)PCR循環(huan)次(ci)數 過多有關(guan)。其次(ci)是酶的(de)質和(he)量(liang)，往往(wang)壹些來源(yuan)的(de)酶易(yi)出(chu)現非特異(yi)條帶而(er)另(ling)壹來源(yuan)的(de)酶 則(ze)不(bu)出(chu)現，酶量(liang)過多有時也會出(chu)現非特異(yi)性擴(kuo)增(zeng)。其對(dui)策(ce)有：必要時重新(xin)設(she)計(ji)引 物。減低(di)酶量(liang)或調(tiao)換另(ling)壹來源(yuan)的(de)酶。降(jiang)低引(yin)物量(liang)，適(shi)當(dang)增(zeng)加模(mo)板(ban)量(liang)，減少(shao)循(xun)環(huan)次(ci) 數。適(shi)當(dang)提高(gao)退火溫度或(huo)采(cai)用二(er)溫度點(dian)法(93℃變(bian)性，65℃左(zuo)右退火與延伸)。

出(chu)現片(pian)狀拖帶或塗(tu)抹(mo)帶
　　PCR擴(kuo)增(zeng)有時出(chu)現塗(tu)抹(mo)帶或片(pian)狀帶或地毯(tan)樣(yang)帶。其原(yuan)因往(wang)往(wang)由(you)於酶量(liang)過多或酶的(de)質量(liang) 差，dNTP濃度過高(gao)，Mg2+濃(nong)度(du)過高(gao)，退火溫度過(guo)低(di)，循(xun)環(huan)次(ci)數過多引起。其對(dui)策(ce)有：減少(shao)酶量(liang)，或調(tiao)換另(ling)壹來源(yuan)的(de)酶。②減少(shao)dNTP的(de)濃度(du)。適(shi)當(dang)降低(di)Mg2+濃 度。增(zeng)加模(mo)板(ban)量(liang)，減少(shao)循(xun)環(huan)次(ci)數。

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