SDS-聚(ju)丙烯酰胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)實驗(yan)步(bu)驟(zhou)

SDS-聚(ju)丙烯酰胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)原理：

SDS-聚(ju)丙烯酰胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)，是(shi)在(zai)聚(ju)丙烯酰胺(an)凝(ning)膠系(xi)統(tong)中引(yin)進SDS（十(shi)二烷(wan)基硫酸鈉(na)）， SDS會與(yu)變性的(de)多(duo)肽，並(bing)使(shi)蛋(dan)白(bai)帶(dai)負電(dian)荷(he)，由於多(duo)肽結合SDS的(de)量幾乎總(zong)是(shi)與(yu)多(duo)肽的(de)分子量成正(zheng)比(bi)而(er)與其序(xu)列(lie)無(wu)關，因此(ci)SDS多(duo)肽復合物在(zai)丙稀酰胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)中(zhong)的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)只與(yu)多(duo)肽的(de)大小有關(guan)，在(zai)達到飽(bao)和的(de)狀態(tai)下，每克(ke)多(duo)肽可與(yu)1.4g去(qu)汙(wu)劑結合。

當分子量在15KD到200KD之(zhi)間時(shi)，蛋(dan)白(bai)質的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)和分子量的(de)對數呈線性(xing)關(guan)系，符合(he)下(xia)式(shi)：logMW=K-bX，式中：MW為分子量，X為遷(qian)移(yi)率(lv)，k、b均(jun)為常(chang)數，若(ruo)將(jiang)已(yi)知(zhi)分子量的(de)標準蛋(dan)白(bai)質的(de)遷(qian)移(yi)率(lv)對分子量對數作圖(tu)，可獲(huo)得壹(yi)條標(biao)準曲(qu)線，未知蛋(dan)白(bai)質在(zai)相同條(tiao)件(jian)下進(jin)行電(dian)泳(yong)，根據(ju)它(ta)的(de)電泳(yong)遷(qian)移(yi)率(lv)即(ji)可在(zai)標(biao)準曲(qu)線上(shang)求(qiu)得分子量。

SDS-聚(ju)丙烯酰胺(an)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)常(chang)用試劑及(ji)設(she)備

試劑：蛋(dan)白(bai)值(zhi)樣(yang)品，SDS-PAGE loading buffer，PBS，Tris-Hcl (PH 8.8)， Tris-Hcl (PH 6.8) ，30%丙烯酰胺(an)，10%SDS，10%過(guo)硫酸，5×SDS-PAGE電(dian)泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)，考馬斯(si)亮(liang)藍(lan)R-250染(ran)色(se)液(ye)，脫色(se)液(ye)、天(tian)能(neng)預(yu)制膠(jiao)。

儀器耗材：垂直(zhi)電泳(yong)槽(cao)，電(dian)泳(yong)儀，電(dian)泳(yong)儀電(dian)源，移(yi)液(ye)槍，移(yi)液(ye)槍tip吸頭，離(li)心(xin)管、試劑瓶(ping)。

實驗(yan)步(bu)驟(zhou)

壹(yi)、凝(ning)膠配置(zhi)

1．分離(li)膠(jiao)的(de)配制(zhi)

（1）找出(chu)配套(tao)的(de)膠板，用擦(ca)鏡(jing)紙擦(ca)幹凈(jing)，並(bing)固定在(zai)配膠(jiao)器上。隨(sui)後(hou)用去(qu)離(li)子水試漏；

（2）若(ruo)膠(jiao)板不漏水，就(jiu)進行分離(li)膠(jiao)的(de)配制(zhi)。依(yi)次將水(shui)、30%丙烯酰胺(an)、1.5M Tris-Hcl（PH 8.8）、10%SDS、10%過(guo)硫酸銨(an)加(jia)到幹凈(jing)的(de)小燒(shao)杯中，混勻(yun)（1mm的(de)膠板，壹(yi)般配壹(yi)塊膠(jiao)用5ml。所配的(de)膠濃(nong)度壹(yi)般為(wei)12%，但(dan)濃(nong)度也(ye)要(yao)視(shi)情況(kuang)而定。蛋(dan)白(bai)越(yue)小，膠的(de)濃(nong)度越(yue)大）；

（3）將膠(jiao)板中的(de)水倒(dao)掉，並(bing)用濾紙吸幹水(shui)分（不要(yao)將(jiang)濾紙塞到膠(jiao)板底(di)部(bu)）；

（4）小燒(shao)杯中再(zai)加(jia)入(ru)TEMED，混勻(yun)。（TEMED可使(shi)膠(jiao)凝(ning)固，所以(yi)最(zui)後(hou)加(jia)）；

（5）灌膠(jiao)：混勻(yun)的(de)分離(li)膠(jiao)沿(yan)著膠(jiao)板邊緣(yuan)輕輕灌下，防止產(chan)生(sheng)氣泡(pao)；

（6）用水將(jiang)分離(li)膠(jiao)壓平（用水灌(guan)滿，同時(shi)加(jia)水時(shi)要(yao)緩(huan)慢(man)加(jia)入(ru)，防止把膠(jiao)吹(chui)起）。

也可以(yi)直(zhi)接(jie)使用預制(zhi)膠，預(yu)制(zhi)膠(jiao)直(zhi)接(jie)拆開即(ji)用，不用配制(zhi)。

2．濃(nong)縮(suo)膠的(de)配制(zhi)

（1）待(dai)分離(li)膠(jiao)與水中間(jian)形(xing)成明顯的(de)橫線，即(ji)分離(li)膠(jiao)凝(ning)固。隨(sui)後(hou)進行濃(nong)縮(suo)膠的(de)配制(zhi)，依(yi)次將水(shui)、30%丙烯酰胺(an)、1.0M Tris-Hcl（PH 6.8）、10%SDS、10%過(guo)硫酸銨(an)加(jia)到幹凈(jing)的(de)小燒(shao)杯中；

（2）將(jiang)分離(li)膠(jiao)上層的(de)水倒(dao)掉，並(bing)用濾紙吸幹水(shui)分（盡(jin)量不要(yao)把濾紙插(cha)入(ru)）；

（3）小燒(shao)杯中再(zai)加(jia)入(ru)TEMED，混勻(yun)；

（4）灌膠(jiao)。然(ran)後(hou)插(cha)入(ru)梳子；

（5）把制(zhi)膠(jiao)器倒(dao)過(guo)來，膠(jiao)仍(reng)然(ran)不會往(wang)外流，或(huo)可以(yi)明(ming)顯(xian)看(kan)出(chu)梳(shu)子中兩個齒(chi)之(zhi)間的(de)膠面(mian)明(ming)顯凹下去(qu)，說(shuo)明(ming)濃(nong)縮(suo)膠凝(ning)固。將(jiang)凝(ning)固的(de)膠板裝(zhuang)入(ru)電泳(yong)槽(cao)內(nei)，並在(zai)電(dian)泳(yong)槽(cao)內(nei)加(jia)入(ru)SDS-PAGE電泳(yong)緩(huan)沖(chong)液(ye)，把膠(jiao)浸(jin)泡(pao)壹(yi)段時間，時間(jian)越(yue)長(chang)越(yue)好（防(fang)止梳(shu)子與膠相連，或(huo)膠因濕(shi)度不夠而縮(suo)減(jian)）；

（6）點(dian)樣(yang)時(shi)，再把梳(shu)子拔出(chu)來，拔(ba)時(shi)動作要(yao)輕，防止膠(jiao)齒(chi)被拔斷(duan)。

二、SDS-PAGE電(dian)泳(yong)步(bu)驟(zhou)

1、調膠(jiao)：拔掉SDS膠上的(de)梳子，並用小針調(tiao)整齒的(de)位置(zhi)（使它們(men)都(dou)平(ping)行）。

2、點(dian)樣(yang)：用20µL的(de)小槍頭(tou)，吸(xi)煮過(guo)的(de)樣品10µL，對準膠孔(kong)點樣(yang)，註意不要(yao)把樣(yang)品點在(zai)外(wai)面(mian)。使(shi)用適當(dang)的(de)分子量蛋(dan)白(bai)marker。

3、電(dian)泳(yong)：電(dian)泳(yong)儀正(zheng)負極(ji)接(jie)好，打(da)開(kai)電(dian)源。濃(nong)縮(suo)膠：電(dian)壓 low 100V，分離(li)膠(jiao)：電壓 high 150V。

4、卸膠(jiao)：等膠(jiao)內(nei)的(de)所有的(de)藍(lan)色(se)都(dou)跑(pao)出(chu)去(qu)，電(dian)泳(yong)停(ting)止，壹(yi)般時(shi)間為1-2小時左(zuo)右(you)。把膠(jiao)板從(cong)電(dian)泳(yong)儀上(shang)卸下(xia)，用刀(dao)片把膠(jiao)板撬開，膠(jiao)的(de)濃(nong)縮(suo)膠部(bu)分割除(chu)；

5、染(ran)色(se)：放(fang)入(ru)考馬斯(si)亮(liang)藍(lan)R-250染(ran)色(se)液(ye)中(zhong)進(jin)行常(chang)溫過(guo)夜染(ran)色(se)；

5、脫色(se)：將(jiang)過(guo)夜染(ran)色(se)的(de)SDS-PAGE膠放(fang)入(ru)脫色(se)液(ye)中(zhong)進(jin)行脫色(se)，直(zhi)到背(bei)景(jing)發(fa)白(bai)。

   蘇(su)州阿爾法生(sheng)物是(shi)壹(yi)家集(ji)生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)儀器設(she)備、實驗(yan)耗材和實驗(yan)試(shi)劑供應於(yu)壹(yi)身(shen)的(de)專(zhuan)業公(gong)司(si)。阿(e)爾(er)法(fa)生(sheng)物產(chan)品覆蓋(gai)生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)研究(jiu)、生(sheng)物制(zhi)藥、環境監(jian)測(ce)、食品安全等領域(yu)，包括的(de)實驗(yan)室(shi)儀器設(she)備有生(sheng)物顯(xian)微(wei)鏡(jing)、細胞培(pei)養(yang)系統(tong)、蛋(dan)白(bai)電(dian)泳(yong)系(xi)統(tong)、數字PCR儀、高(gao)通量分析(xi)儀、高(gao)速(su)冷凍離(li)心(xin)機、超速(su)離(li)心(xin)機、臺式高(gao)速(su)離(li)心(xin)機、低(di)速(su)離(li)心(xin)機、落地式(shi)離(li)心(xin)機、迷(mi)妳離(li)心(xin)機、真空濃(nong)縮(suo)儀、恒(heng)溫恒(heng)濕培(pei)養(yang)箱(xiang)、生(sheng)物反(fan)應(ying)器、細菌(jun)培(pei)養(yang)箱(xiang)研磨(mo)儀等，實驗(yan)耗材常用的(de)nest培(pei)養(yang)瓶(ping)、rainin移(yi)液(ye)槍tip頭、離(li)心(xin)管、PCR管、8聯排管(guan)、三角搖(yao)瓶(ping)、培(pei)養(yang)皿等，實驗(yan)試(shi)劑包括天(tian)根試(shi)劑盒(he)、質粒抽提(ti)試劑盒(he)、蛋(dan)白(bai)抗(kang)體、碧(bi)雲(yun)天(tian)試(shi)劑、阿(e)拉丁(ding)試劑、腫瘤(liu)細胞株、基因編(bian)輯(ji)細胞、支(zhi)原體清(qing)除(chu)試(shi)劑盒(he)等。阿(e)爾法生(sheng)物壹(yi)直(zhi)與國(guo)際(ji)生(sheng)命(ming)科(ke)學(xue)儀器廠(chang)商(shang)以(yi)及(ji)壹(yi)些新興(xing)科(ke)技(ji)公司(si)保持著(zhe)深度的(de)合作關(guan)系(xi)，這(zhe)也(ye)為產(chan)品供應和技(ji)術(shu)支(zhi)持提(ti)供了有(you)力保障。 作為(wei)十四(si)年(nian)年(nian)專(zhuan)註於(yu)實驗(yan)室(shi)儀器設(she)備、實驗(yan)耗材和實驗(yan)試(shi)劑供應商(shang)，無(wu)論是實驗(yan)室(shi)的(de)常規使(shi)用，還(hai)是(shi)科(ke)研人員(yuan)的(de)前沿(yan)探(tan)索(suo)，阿(e)爾法生(sheng)物都(dou)能(neng)夠(gou)為您(nin)提(ti)供良好的(de)軟硬件(jian)支(zhi)持和快捷、周(zhou)到的(de)服務。