瓊(qiong)脂(zhi)糖凝(ning)膠電(dian)泳(yong)實驗步(bu)驟(zhou)

(1)安裝電(dian)泳管(guan)

選(xuan)擇(ze)聚(ju)含均勻(yun)、無(wu)氣(qi)泡、無裂縫、膠面(mian)平整並(bing)與管(guan)壁(bi)沒(mei)有(you)脫離(li)現象(xiang)的(de)合格(ge)凝(ning)膠電(dian)泳(yong)管 插(cha)入上電極(ji)槽(cao)底板(ban)的(de)各圓孔(kong)中，留1/5在(zai)底(di)板上(shang)方，保(bao)證使電泳管(guan)與底(di)板(ban)垂直(zhi)，密(mi)封(feng)處不(bu) 致滲漏(lou)。

(2) 加(jia)樣(yang)

可(ke)利(li)用上述方法(fa)制成樣(yang)品(pin)膠，也可(ke)以用(yong)如(ru)下的(de)壹(yi)種(zhong)方法(fa)加(jia)樣(yang)。

將樣(yang)品(pin)溶於200mg/ml濃(nong)度的(de)蔗(zhe)糖(tang)溶(rong)液中，或溶在(zai)10%甘油(you)中，然後(hou)加(jia)在(zai)濃(nong)縮(suo)膠的(de) 表(biao)面(mian)。

或將熔化(hua)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)與樣(yang)品(pin)溶液混合後(hou)加(jia)在(zai)濃(nong)縮(suo)膠表(biao)面(mian)。

或用與電(dian)泳(yong)管內(nei)徑(jing)相(xiang)近(jin)的(de)圓形(xing)厚(hou)濾紙片，將樣(yang)品(pin)溶液吸(xi)收(shou)後(hou)，緊貼(tie)在(zai)濃(nong)縮(suo)膠表(biao)面(mian)。 如(ru)樣(yang)品(pin)是固體(ti)，應(ying)先(xian)溶在(zai)濃(nong)縮(suo)膠緩沖(chong)液中，並加(jia)入足(zu)夠量(liang)lmol/L的(de)蔗(zhe)糖(tang)溶(rong)液，使(shi)樣(yang) 品(pin)溶液的(de)比(bi)重(zhong)增(zeng)大，再加(jia)在(zai)濃(nong)縮(suo)膠表(biao)面(mian).

加(jia)樣(yang)體(ti)積(ji)壹(yi)般不(bu)超過100山(shan)常(chang)用(yong)雖(sui)為20〜50山(shan) 含(han)量(liang)不(bu)超過100昭(zhao),常(chang)用(yong)量(liang)為(wei)20〜 5外(wai)拿(na)如(ru)果(guo)樣(yang)品(pin)是壹個(ge)多組(zu)分的(de)混合物，加(jia)樣(yang)量(liang)可(ke)增加(jia)到(dao)200_Mgo如(ru)果(guo)樣(yang)品(pin)是壹種(zhong)抽提液, 必須去(qu)除有形(xing)顆粒(li)，取可(ke)溶部(bu)分上(shang)樣(yang)。

必須保(bao)證樣(yang)品(pin)溶液具(ju)有低電(dian)導性(xing)，鹽濃(nong)度不(bu)應超過0. 05mol/L_o

目前(qian)常用(yong)的(de)加(jia)樣(yang)方法(fa)是：用(yong)稀釋(shi)5-10倍(bei)的(de)濃(nong)縮(suo)膠緩沖(chong)液，使(shi)其(qi)成lmg/ml的(de)濃(nong) 度(du)，再加(jia)蔗(zhe)糖(tang)使(shi)成濃(nong)度，然(ran)後(hou)在(zai)濃(nong)縮(suo)膠面(mian)上有(you)電極(ji)緩沖(chong)液存在(zai)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)，用(yong)合 適(shi)的(de)加(jia)樣(yang)工(gong)具(ju)如(ru)微(wei)堇註射(she)器，插(cha)入濃(nong)縮(suo)膠面(mian)與上(shang)方的(de)電(dian)極(ji)緩沖(chong)液界面(mian)處，輕(qing)輕地將樣(yang)品(pin)加(jia) 在(zai)濃(nong)縮(suo)膠面(mian)上.

(3) 加(jia)電(dian)極(ji)緩沖(chong)液

樣(yang)品(pin)加(jia)入後(hou)，在(zai)上(shang)下兩個電極(ji)槽(cao)中灌註電極(ji)緩沖(chong)液，緩沖(chong)液的(de)溫(wen)度需與電(dian)泳(yong)溫(wen)度壹 致。加(jia)入緩沖(chong)液時(shi)應小(xiao)心(xin)操(cao)作(zuo)，不能(neng)攪(jiao)動電泳管(guan)中的(de)樣(yang)品(pin)溶液，並(bing)不使(shi)電泳(yong)管(guan)上(shang)下口(kou)留有 氣(qi)泡(pao)。緩沖(chong)液的(de)用(yong)垃(la)隨容(rong)器(qi)的(de)大小(xiao)而(er)有異(yi)。壹般情(qing)況下(xia)電極(ji)槽(cao)中的(de)緩沖(chong)液量(liang)能(neng)使(shi)電泳管 至少有(you)3/5浸入緩沖(chong)液為(wei)宜。

(4) 加(jia)指(zhi)示(shi)染(ran)料

對於誠(cheng)性(xing)系統(tong)常(chang)用(yong)的(de)指(zhi)示(shi)染(ran)料為0. 001%漠(mo)酚藍，酸性(xing)系統(tong)常(chang)用(yong)的(de)是(shi)0. 005%甲基綠 或甲烯藍。用(yong)量(liang)為(wei)每(mei)500ml緩沖(chong)液加(jia)指(zhi)示(shi)染(ran)料1ml_D 壹(yi)般加(jia)在(zai)上(shang)電極(ji)槽(cao)緩沖(chong)液中。

另(ling)有壹(yi)種辦(ban)法(fa)是將染料(liao)配制成0. 1%濃(nong)度的(de)溶(rong)液，每(mei)管加(jia)5貝(bei)，與樣(yang)品(pin)溶液混合後(hou)加(jia) 入。

(5) 電(dian)泳(yong)

裝(zhuang)配好電(dian)極(ji)，接(jie)通(tong)直(zhi)流電源。堿(jian)性(xing)系統(tong)上(shang)電(dian)極(ji)接(jie)負(fu)極(ji)，酸性(xing)系統(tong)上(shang)電(dian)極(ji)接(jie)正(zheng)極(ji)。

對於直(zhi)徑(jing)5〜7mm的(de)凝(ning)膠，最(zui)初(chu)2分鐘(zhong)用(yong)1mA/管(guan)的(de)電(dian)流進(jin)行(xing)電(dian)泳(yong)，然後(hou)逐漸升(sheng)高到(dao) 2〜5mA/管(guan)（10分鐘(zhong)）。通(tong)常(chang)5mm X 65mm的(de)凝(ning)膠在(zai)20 C時(shi)用(yong)4mA/管(guan)進(jin)行(xing)電(dian)泳(yong),大約(yue)需

時(shi)40分鐘(zhong)。

在(zai)電(dian)泳過程(cheng)中，常要求電(dian)流保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)。此時，電壓(ya)會有(you)升高。如(ru)果(guo)電流大而(er)產(chan)生(sheng)過高 的(de)歐(ou)姆熱(re)，影(ying)響(xiang)某些(xie)樣(yang)品(pin)時，可(ke)以降(jiang)低電(dian)流而延長(chang)電泳(yong)時間。

可(ke)以看(kan)岀(岀)，由(you)於(yu)水(shui)的(de)電(dian)解(jie)在(zai)負(fu)極(ji)產生(sheng)H2,在(zai)正(zheng)極(ji)產生(sheng)1/2 O2,同時(shi),HA不(bu)斷(duan)消耗(hao)。從 兩個電極(ji)反應(ying)可(ke)以知(zhi)道(dao)：為(wei)了(le)保(bao)持(chi)緩沖(chong)液有(you)幾乎(hu)不變的(de)緩沖(chong)能(neng)力，上下(xia)電極(ji)槽(cao)必須足(zu)夠 大，以(yi)盛放足(zu)夠量(liang)的(de)緩沖(chong)液。

有(you)時(shi)候(hou)，我(wo)們(men)需要(yao)進(jin)行(xing)長(chang)時間的(de)電(dian)泳(yong)。例(li)如(ru):DNA的(de)分離(li)有(you)時(shi)長(chang)達10余(yu)小(xiao)時(shi)。為了(le)防 止(zhi)由(you)於(yu)電(dian)極(ji)反應(ying)使緩沖(chong)能(neng)力耗(hao)盡從(cong)而(er)引起pH的(de)變化(hua)影(ying)響(xiang)分離(li)，1977年(nian)美國(guo)匹茲堡大學(xue) T.G. Cooper提出(chu)用(yong)循環(huan)緩沖(chong)液的(de)辦(ban)法(fa)來保(bao)持(chi)緩沖(chong)能(neng)力不致耗(hao)盡，以(yi)達(da)到緩沖(chong)溶液能(neng)較(jiao) 長(chang)期(qi)使(shi)用的(de)目的(de)。

Cooper的(de)循(xun)環(huan)緩沖(chong)液方法(fa)示(shi)意見(jian)圖2-3_o

上(shang)下(xia)兩個電極(ji)槽(cao)的(de)緩沖(chong)溶液水(shui)平保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)，但(dan)又(you)沒(mei)有(you)建(jian)立(li)通(tong)路。下槽(cao)的(de)緩沖(chong)液可(ke)靠(kao)輸 液器(qi)壹滴(di)壹滴(di)地滴入上槽(cao)。而當(dang)上槽(cao)的(de)緩沖(chong)液增(zeng)加(jia)時(shi)，就會經(jing)溢(yi)流管滴回(hui)到(dao)下槽(cao)，使上(shang)下(xia) 兩槽(cao)的(de)緩沖(chong)液水(shui)平在(zai)電(dian)泳過程(cheng)中始終保(bao)持(chi)恒(heng)定(ding)。要(yao)註意的(de)是(shi),滴(di)入上槽(cao)中的(de)緩沖(chong)液，必須 不是線(xian)狀連續的(de)。

凝(ning)膠的(de)取(qu)出(chu)

電(dian)泳(yong)結(jie)束取出(chu)電泳(yong)管(guan)。然(ran)後(hou),用配有細(xi)長(chang)針(zhen)頭並(bing)盛有水(shui)的(de)註射(she)器，將針(zhen)頭小(xiao)心(xin)地插(cha)入 凝(ning)膠和(he)玻璃管(guan)壁之(zhi)間，邊插(cha)入轉動管子(zi)同時(shi)壓(ya)進(jin)壹(yi)些(xie)水，另(ling)壹端(duan)也作(zuo)同樣(yang)處(chu)理(li)。然(ran)後(hou)，將管

F套(tao)上(shang)橡(xiang)皮管用(yong)自來水(shui)壓(ya)力壓(ya)出(chu)凝(ning)膠，或用洗耳(er)球(qiu)壓(ya)岀(岀)凝(ning)膠。如(ru)果(guo)壓(ya)岀(岀)凝(ning)膠困(kun)難(nan)時(shi)，註射(she) 器(qi)內(nei)可(ke)裝甘油(you)代替水壓(ya)入凝(ning)膠和(he)管壁之(zhi)間。也可(ke)以用(yong)壹(yi)根(gen)金(jin)屬(shu)細(xi)絲(si)，從凝(ning)膠和(he)管壁之(zhi)間穿(chuan) 過整(zheng)個玻(bo)璃管(guan)，然(ran)後(hou)，拉(la)緊金(jin)屬(shu)細(xi)絲(si)轉動玻璃管(guan)壹周，就能(neng)使(shi)凝(ning)膠脫離(li)管(guan)壁(bi)，再用(yong)洗耳(er)球(qiu)擠(ji) 壓(ya)，就很容(rong)易(yi)壓(ya)出。

也可(ke)以將電泳(yong)管浸入甲醇中，使凝(ning)膠收(shou)縮(suo)與管(guan)壁(bi)脫離(li)而(er)取(qu)岀(岀)，或根(gen)據(ju)具(ju)體(ti)條(tiao)件(jian)用(yong)別的(de) 辦(ban)法(fa)取出(chu)凝(ning)膠。但(dan)必須註意，無(wu)論(lun)用(yong)何種辦(ban)法(fa)，必須不損傷(shang)膠面(mian)。特(te)別是濃(nong)度低的(de)大孔(kong)凝(ning) 膠，宙(zhou)「機(ji)械(xie)強(qiang)度(du)差，取岀(岀)時應(ying)格(ge)外小(xiao)心(xin)。

凝(ning)膠的(de)染(ran)色(se)——分離(li)區(qu)帶(dai)的(de)檢(jian)出

(1)蛋白質(zhi)的(de)壹(yi)般染(ran)色方法(fa)

固定(ding)和(he)染色常(chang)可(ke)同時(shi)進(jin)行(xing)。因(yin)為(wei)，染料的(de)溶(rong)劑(ji)壹(yi)般就是固定(ding)劑(ji).常用的(de)幾種染色(se)方法(fa) 簡述如(ru)下：

(i) 氯(lv)基黑(hei)10B (amido black 10B)用(yong)7%的(de)醋(cu)酸配制0. 5%〜1%的(de)染(ran)料(liao)溶(rong)液，浸 染(ran)2〜6小(xiao)時(shi)，染色(se)後(hou)用水(shui)洗。

用(yong)7%的(de)醋(cu)酸配制1%的(de)染(ran)料(liao)溶(rong)液,96 C保(bao)溫(wen)染色10分鐘(zhong)，可(ke)以改(gai)善對弱區(qu)帶(dai)的(de)分辨(bian) 率(lv)。

(ii) 考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍 R-250 (Coomassie brilliant blue R-250)先(xian)用 12. 5%三(san)氯(lv)醋(cu)酸固 定(ding)數(shu)小(xiao)時(shi)，出現白色沈(chen)澱條(tiao)紋(wen)後(hou)，在(zai)三(san)氯(lv)醋(cu)酸中滴加(jia)少(shao)量(liang)1 %考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍R-250溶(rong)液，過 夜(ye)，用(yong)此法(fa)染色(se)底色(se)很淺(qian)，通常(chang)染色(se)後(hou)不需脫色。

或用0. 25%考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍R-25O的(de)甲醇-醋(cu)酸混合液(454ml 50%的(de)甲醇+ 46ml冰(bing)醋(cu) 酸)染(ran)色2-10小(xiao)時(shi)。

或先(xian)用20%磺(huang)基(ji)水(shui)楊酸固定(ding)18小(xiao)時(shi)，然後(hou)用0. 25%考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍R-25O的(de)無(wu)重(zhong)金(jin)屬(shu) 離(li)子(zi)的(de)水(shui)溶(rong)液染(ran)色0. 5〜2小(xiao)時(shi)。或用0. 25%考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍R-250的(de)9%醋(cu)酸和(he)45%甲醇 混合液染(ran)色0. 5-2小(xiao)時(shi)。

(iii) 考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍G-250先(xian)在(zai)5%三(san)氯(lv)醋(cu)酸中固定(ding)30分鐘(zhong)，水(shui)洗幾次(ci)，然(ran)後(hou)用1% 該(gai)染料(liao)的(de)7%醋(cu)酸溶(rong)液，染(ran)色10分鐘(zhong)。或用0.1%該(gai)染料(liao)的(de)甲醇:水：醋(cu)酸(10 ： 10 ： 1 v/v)混合液，染(ran)色30分鐘(zhong)。

(iv) 固綠(fast green)用(yong)1%固綠的(de)7%醋(cu)酸溶(rong)液，染(ran)色2小(xiao)時(shi)。最(zui)好在(zai)10C以(yi)下(xia)進(jin) 行(xing)₀

(v) 普施(shi)安亮(liang)藍RS (Procion brillant blue RS)先(xian)在(zai)20%磺(huang)基(ji)水(shui)揚酸固定(ding)0. 5〜2 小(xiao)時(shi)，然後(hou)用1%該(gai)染料(liao)的(de)10%醋(cu)酸和(he)50%甲醇混合液染(ran)色1〜2小(xiao)時(shi)。

(vi) 1%考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍R-250溶(rong)劑(ji)是(shi)水：甲醇：冰(bing)醋(cu)酸(5 : 5 ： 2),使(shi)用(yong)前(qian)用濾紙 過濾去(qu)除不溶(rong)物。柱狀凝(ning)膠條(tiao)室(shi)溫(wen)染色至少4小(xiao)時(shi)。1.5mm厚(hou)的(de)平板凝(ning)膠，室(shi)溫(wen)染色4〜 6小(xiao)時(shi)。

(vii) 硫酸銅-考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍混合染色(se)液10g硫酸銅定(ding)溶(rong)於800ml蒸(zheng)偕(xie)水中，再加(jia)入 200ml醋(cu)酸作(zuo)為染(ran)色(se)貯備(bei)液A。

3g考(kao)馬(ma)斯亮(liang)藍G-25O溶(rong)於(yu)900ml甲醇中，再加(jia)蒸(zheng)饞(chan)水(shui)至1 000ml作(zuo)為染(ran)色(se)貯備(bei)液B。 使(shi)用(yong)前(qian)等體(ti)積(ji)攪(jiao)拌(ban)混合貯備(bei)液A和(he)染色30分鐘(zhong)至數(shu)小(xiao)時(shi)視(shi)不(bu)同樣(yang)品(pin)而異。

更(geng)多(duo)電(dian)泳相(xiang)關設備(bei)進(jin)入蘇州(zhou)阿(e)爾法(fa)生(sheng)物(wu)實驗器材(cai)有(you)限公司進(jin)行(xing)了(le)解(jie)咨(zi)詢。