原(yuan)生質體葉肉(rou)細(xi)胞瞬(shun)時表達(da)實(shi)驗步(bu)驟

原(yuan)生質體葉肉(rou)細(xi)胞瞬(shun)時表達(da)實(shi)驗步(bu)驟
1、生(sheng)長(chang)培(pei)養(yang)好的(de)試(shi)驗材(cai)料（壹(yi)般(ban)為生(sheng)長(chang)20天(tian)左(zuo)右的(de)擬南芥幼苗(miao)葉片(pian)）
2、在(zai)擬南芥開花(hua)前取(qu)樣（30片(pian)葉子(zi)左(zuo)右即(ji)可(ke)）
3、切取葉片(pian)為(wei)0.5-1mm的細條（如果(guo)材料能(neng)達(da)到每(mei)克(ke)107個(ge)原(yuan)生質體，10-20片(pian)葉子(zi)需要5-10mL酶(mei)解液(ye)）
4、迅(xun)速將切下的(de)樣品轉(zhuan)到酶(mei)解液(ye)中，要(yao)求(qiu)全浸沒(mei)。
5、黑暗條件(jian)下(xia)抽真(zhen)空(kong)30min。
6、連續酶(mei)解，室溫下(xia)23℃黑(hei)暗中靜(jing)止酶(mei)解3h
7、利用光學顯(xian)微鏡檢查(zha)原(yuan)生質體（30-50μm大(da)小）
8、在過(guo)濾前加入等量的(de)W5溶液(ye)
9、洗(xi)幹凈(jing)濾網，並(bing)用W5潤(run)濕，之(zhi)後過(guo)濾
10、離(li)心100g，1-2min沈澱原(yuan)生質體，盡可(ke)能吸走(zou)上(shang)清(qing)，重(zhong)復洗(xi)2次
11、重(zhong)懸原(yuan)生質體於(yu)W5中，保(bao)持在2*105個(ge)/ml，冰(bing)浴30min。
12、100g離(li)心2min，盡可(ke)能吸走(zou)上(shang)清(qing)，利用MMG重(zhong)懸，濃度(du)約(yue)2*105個(ge)/ml
13、加入10μL質粒（1000ng-2000ng）於(yu)2ml離(li)心管中
14、加入100μL原(yuan)生質體（2*104個(ge)），輕(qing)輕混(hun)勻。
15、加110μL PEG solution，輕彈使充分(fen)混(hun)勻
16、23℃室溫孵育30min。
17、加400-440μL W5混(hun)勻，終止反應(ying)
18、100g，2min 23℃離(li)心，去上(shang)清(qing)，重(zhong)復洗(xi)壹(yi)次(ci)
19、用1mL W5重(zhong)懸原(yuan)生質體並(bing)放入6孔(kong)板中培(pei)養(yang)
20、20-25℃孵育16h以(yi)上(shang)
21、取(qu)樣制片(pian)觀(guan)察(cha)
 
溶液(ye)配制：
1、酶(mei)解液(ye)的(de)配制（20ml）試(shi)劑(ji)終濃度(du)質量/g

W5溶液(ye)配制（500mL）

MMG配制（100mL）

PEG配制（10mL）