基因定(ding)點(dian)突(tu)變技術(shu)

  體外定點(dian)突(tu)變技術(shu)是(shi)當(dang)前(qian)生物學(xue)各領(ling)域(yu)研(yan)究中(zhong)的(de)壹(yi)種(zhong)重(zhong)要實驗(yan)手段，是(shi)改(gai)造(zao)、優(you)化(hua)基因的(de)便(bian)捷方(fang)案(an)，是(shi)探(tan)索啟動子(zi)調節位(wei)點(dian)的有(you)效手段，也(ye)是(shi)研(yan)究蛋(dan)白質結(jie)構和功能之(zhi)間(jian)的復(fu)雜(za)關系(xi)的有(you)力(li)工(gong)具(ju)。

 
   蛋(dan)白質的(de)結構決定其功能，二(er)者之(zhi)間(jian)的關系(xi)是(shi)蛋(dan)白質組(zu)研(yan)究的(de)重(zhong)點(dian)之壹(yi)。對(dui)某個已知基因的(de)特(te)定堿(jian)基進(jin)行(xing)定點(dian)改變、缺失(shi)或者插(cha)入，可(ke)以改變對(dui)應的氨基酸(suan)序(xu)列(lie)和蛋(dan)白質結(jie)構，對(dui)突(tu)變基因的(de)表(biao)達產(chan)物進(jin)行(xing)研(yan)究有(you)助於(yu)人(ren)類了(le)解蛋(dan)白質結(jie)構和功能的(de)關系(xi)，探(tan)討蛋(dan)白質的(de)結構/結構域(yu)。
 
CRISPR-Cas9系統(tong)的靶向雙(shuang)鏈斷(duan)裂（DSB），基因組(zu)通(tong)常通(tong)過非(fei)同源(yuan)端(duan)連接（NHEJ）進(jin)行(xing)修復(fu)，通(tong)過插(cha)入和缺失(shi)誘(you)導(dao)基因敲(qiao)除（Indels）。基因敲(qiao)入(ru)和精(jing)確突(tu)變的引入(ru)可(ke)以通過使(shi)用供(gong)體DNA模(mo)板的同(tong)源(yuan)定(ding)向修復(fu)（HDR）來(lai)實現，但(dan)其效(xiao)率通(tong)常很(hen)低(di)，可(ke)通過(guo)增(zeng)加(jia)抗性篩選來(lai)富集(ji)陽性克隆，但(dan)獲得(de)純(chun)合克隆的概率(lv)極(ji)低(di)。這(zhe)阻礙了(le)該(gai)技術(shu)在臨(lin)床應(ying)用中(zhong)的發展。但(dan)研(yan)究發(fa)現使用(yong)ssodn作(zuo)為供體模(mo)板時，因為ssodn片段較(jiao)短，同源(yuan)定(ding)向修復(fu)（HDR）獲(huo)得(de)純(chun)合的概率遠(yuan)高(gao)於(yu)DNA模(mo)板的同(tong)源(yuan)定(ding)向修復(fu)。
 
常(chang)用的(de)定點(dian)突(tu)變CRISPR-Cas9系統電轉(zhuan)方(fang)法(fa)是(shi)將 gRNA 和 Cas9 蛋(dan)白孵(fu)育結(jie)合為 RNP，加(jia)入ssodn壹(yi)起(qi)電轉(zhuan)到(dao)靶細胞(bao)中，進(jin)行(xing)單 sgRNA 切(qie)割。實現突(tu)變位(wei)點(dian)周圍(wei)基因斷(duan)裂。
 
如(ru)何(he)快速(su)高(gao)效(xiao)構(gou)建(jian)自己(ji)的(de)基因突(tu)變細胞(bao)株(zhu)是(shi)很(hen)多(duo)人(ren)關心(xin)的問(wen)題，我(wo)們梳(shu)理了(le)3個步(bu)驟幫妳(ni)顯著提(ti)高(gao)點(dian)突(tu)變實驗(yan)成功率(lv)：
（1）切(qie)割位(wei)點(dian)到(dao)突(tu)變位(wei)點(dian)的距(ju)離(li)；
（2）引入(ru)同義(yi)突(tu)變，防止Cas9-sgRNA的二(er)次(ci)切(qie)割；
（3）通過優(you)化(hua)距(ju)離(li)提高(gao)純(chun)合或者雜(za)合的偏(pian)向(xiang)性。
 
1. 切(qie)割位(wei)點(dian)到(dao)突(tu)變位(wei)點(dian)的距(ju)離(li)
 
獲得(de)純(chun)和點(dian)突(tu)變細胞(bao)株(zhu)首(shou)要(yao)標準(zhun)是(shi)切(qie)割位(wei)點(dian)到(dao)突(tu)變位(wei)點(dian)的距(ju)離(li)，最(zui)好(hao)不(bu)要超(chao)過(guo)10bp,小於(yu)5bp為最(zui)佳(jia)。突(tu)變位(wei)點(dian)距(ju)離(li)切(qie)割位(wei)點(dian)越近(jin)越好(hao)。
圖片(pian)
因為定點(dian)突(tu)變HDR修復(fu)並(bing)不(bu)需要完(wan)整(zheng)的(de)同源(yuan)臂(bi)作(zuo)為修復(fu)模(mo)板，細胞(bao)可(ke)以僅使用(yong)同源(yuan)臂(bi)的(de)壹(yi)部分(fen)用(yong)於(yu)HDR修復(fu)，這(zhe)使得(de)遠(yuan)離(li)Cas9-sgRNA切(qie)割位(wei)點(dian)的突(tu)變，無法(fa)被有(you)效整(zheng)合進(jin)基因組(zu)。
 
研(yan)究發(fa)現，突(tu)變整(zheng)合效率隨著與(yu)突(tu)變位(wei)點(dian)到(dao)切(qie)割位(wei)點(dian)距(ju)離(li)的增(zeng)加(jia)而迅速(su)下(xia)降(jiang)。與(yu)切(qie)割位(wei)點(dian)距(ju)離(li)10bp整(zheng)合效率下(xia)降(jiang)約壹(yi)半，超(chao)過(guo)30bp則壹(yi)般無(wu)法(fa)整(zheng)合到(dao)基因組(zu)。
 
因此(ci)，我(wo)們通(tong)常(chang)建(jian)議突(tu)變位(wei)點(dian)與(yu)切(qie)割位(wei)點(dian)的距(ju)離(li)不(bu)超過(guo)10bp，從(cong)而保(bao)證較(jiao)高(gao)的(de)整(zheng)合效率。（這(zhe)個也(ye)是(shi)Cas9X | 海(hai)星(xing)生(sheng)物為什(shen)麽建(jian)議細(xi)胞(bao)的點(dian)突(tu)變附近(jin)要有(you)合適的gRNA序(xu)列(lie)）

 
2. 引(yin)入同義(yi)突(tu)變，防止Cas9-sgRNA的二(er)次(ci)切(qie)割
同義(yi)突(tu)變是(shi)指(zhi)：同(tong)義(yi)突(tu)變是(shi)DNA 片(pian)段(duan)中(zhong)有(you)時某個堿(jian)基對(dui)的突(tu)變並不(bu)改變所(suo)編(bian)碼(ma)的氨基酸(suan)。其(qi)原因在於(yu)該(gai)位(wei)置的(de)密(mi)碼(ma)子突(tu)變前後為簡並密碼(ma)子。點(dian)突(tu)變壹(yi)般采(cai)用(yong)單鏈寡(gua)核苷酸(suan)（ssDNA）作(zuo)為HDR模(mo)板，可(ke)以通過在PAM位(wei)點(dian)或者guide區(qu)域(yu)靠近(jin)PAM位(wei)點(dian)引入突(tu)變的方式(shi)，顯著降(jiang)低(di)二(er)次(ci)切(qie)割的概率(lv)。
 
 
如(ru)果(guo)點(dian)突(tu)變位(wei)點(dian)距(ju)離(li)PAM位(wei)點(dian)較(jiao)遠（＞10bp），通常可(ke)以在PAM位(wei)點(dian)附近(jin)引入(ru)同義(yi)突(tu)變，防止二次(ci)切(qie)割。如果(guo)PAM位(wei)點(dian)或者guide區(qu)域(yu)不(bu)在編(bian)碼(ma)區域(yu)上(shang)，無法(fa)引(yin)入(ru)同(tong)義(yi)突(tu)變，該(gai)PAM位(wei)點(dian)或者guide區(qu)域(yu)不(bu)影響外顯子(zi)剪(jian)切(qie)對(dui)該(gai)基因無(wu)影響時(shi)可(ke)直(zhi)接(jie)引入(ru)突(tu)變。否則可(ke)以通過兩(liang)步法(fa)進(jin)行(xing)實驗(yan)：第壹(yi)步，先(xian)引入(ru)點(dian)突(tu)變和PAM位(wei)點(dian)突(tu)變，獲得(de)雙(shuang)突(tu)變的陽性克隆；第二(er)步(bu)，將PAM位(wei)點(dian)突(tu)變回(hui)野(ye)生型(xing)，獲(huo)得(de)僅(jin)靶位(wei)點(dian)突(tu)變的陽性克隆。同義(yi)突(tu)變要選擇突(tu)變成此(ci)轉(zhuan)錄(lu)本被廣泛(fan)使用(yong)的氨(an)基酸(suan)對(dui)應密碼(ma)子，不(bu)要選擇稀有(you)密碼(ma)子。
 
3. 通過(guo)優(you)化距(ju)離(li)提高(gao)純(chun)合或者雜(za)合的偏(pian)向(xiang)性
有(you)壹(yi)些(xie)課題研(yan)究，如(ru)阿(e)爾茨(ci)海(hai)默氏病(bing)的(de)研(yan)究，是(shi)需要用(yong)到(dao)雜合突(tu)變的。而通過(guo)優(you)化突(tu)變位(wei)點(dian)與(yu)切(qie)割位(wei)點(dian)的距(ju)離(li)，可(ke)以幫助我(wo)們更(geng)有(you)效地獲得(de)雜(za)合或者純(chun)合的突(tu)變克隆。

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