細(xi)胞雕(diao)亡(wang)實(shi)驗步(bu)驟(zhou)及註(zhu)意事(shi)項(xiang)

壹(yi)、實(shi)驗目的(de)
1、掌(zhang)屋(wu)雕(diao)亡(wang)細(xi)胞的(de)形(xing)態(tai)特(te)征(zheng)
2、學(xue)會(hui)用熒光(guang)探(tan)針對(dui)細(xi)胞進行雙標記(ji)來檢測(ce)正(zheng)常活細胞、雕(diao)亡(wang)細(xi)胞和(he)壞(huai)死(si)細胞的(de)方法(fa)

二、實(shi)驗原理(li)
細(xi)胞死(si)亡根(gen)據(ju)其性(xing)質、起源(yuan)及生(sheng)物(wu)學(xue)意(yi)義(yi)區分為(wei)雕(diao)亡(wang)和(he)壞(huai)死(si)兩(liang)種(zhong)不同類(lei)型。雕(diao)亡(wang)普(pu)遍(bian)存在(zai)於(yu)生(sheng)命界(jie)，在(zai)生物(wu)個體(ti)和(he)生(sheng)存中(zhong)起著非(fei)常(chang)重要(yao)的(de)作用。它是細胞在(zai)壹定(ding)生理(li)條(tiao)件下(xia)壹(yi)系(xi)列(lie)順(shun)序(xu)發(fa)生(sheng)事(shi)件的(de)組合(he)，是細胞遵循(xun)壹定規律(lv)自己(ji)結束(shu)生(sheng)命的(de)自主控(kong)制過程(cheng)。細(xi)胞雕(diao)亡(wang)具(ju)有(you)可鑒別的(de)形(xing)態(tai)學(xue)和(he)生(sheng)物化學(xue)特(te)征(zheng)。
 
在(zai)形(xing)態(tai)上可見(jian)雕(diao)亡(wang)細(xi)胞與(yu)周圍細胞脫離(li)接(jie)觸，細胞變園，細胞膜向內皺(zhou)縮(suo)、胞漿濃縮(suo)、內(nei)質網擴(kuo)張、細胞核固(gu)縮(suo)破裂呈(cheng)團(tuan)塊狀(zhuang)或(huo)新月(yue)狀(zhuang)分布、內(nei)質網和(he)細(xi)胞膜進壹步(bu)融(rong)合(he)將(jiang)細(xi)胞分成(cheng)多個完整包(bao)裹的(de)雕(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)，雕(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)最後(hou)被吞噬(shi)細(xi)胞吞噬(shi)消(xiao)化。在(zai)雕(diao)亡(wang)過程(cheng)中(zhong)細胞內容物並(bing)不釋(shi)放到細(xi)胞外，不會(hui)影響(xiang)其(qi)它(ta)細胞，因而不引起炎(yan)癥反(fan)應(ying)。
 
在(zai)生物(wu)化學(xue)上，多數(shu)細胞雕(diao)亡(wang)的(de)過程(cheng)中(zhong)，內源性核酸(suan)內切酶(mei)活化，活性(xing)增加。核DNA隨(sui)機地(di)在(zai)核小(xiao)體(ti)的(de)連(lian)接部(bu)位(wei)被(bei)酶(mei)切斷(duan)，降解為(wei)180-200bp或它(ta)的(de)整倍數的(de)各種(zhong)片(pian)斷(duan)。如(ru)果(guo)對(dui)核DNA進(jin)行瓊脂(zhi)糖(tang)電(dian)泳(yong)，可顯示以180-200bp為(wei)基數的(de)DNA ladder（梯狀(zhuang)帶(dai)紋(wen)）的(de)特征(zheng)。
 
相比(bi)之下(xia)，壞(huai)死(si)是細胞處於(yu)劇(ju)烈損傷(shang)條件下(xia)發(fa)生(sheng)的(de)細胞死(si)亡。細(xi)胞在(zai)壞死(si)早(zao)期即(ji)喪(sang)失質膜完整性，各種(zhong)細(xi)胞器(qi)膨(peng)脹，進(jin)而(er)質膜崩解(jie)釋(shi)放出其中(zhong)的(de)內容物，引起炎(yan)癥反(fan)應(ying)，壞(huai)死(si)過程(cheng)中(zhong)細胞核DNA雖(sui)也(ye)降解，但由(you)於(yu)存在(zai)各種(zhong)長(chang)度(du)不等(deng)的(de)DNA片(pian)斷(duan)，不能(neng)形(xing)成(cheng)梯(ti)狀(zhuang)帶(dai)紋(wen)，而呈(cheng)彌散(san)狀(zhuang)。

壹(yi)些(xie)溫(wen)和(he)的(de)損傷(shang)刺(ci)激及壹(yi)些(xie)抗腫(zhong)瘤藥(yao)物可誘(you)導細胞雕(diao)亡(wang)，通(tong)常(chang)這(zhe)些(xie)因(yin)素在(zai)誘(you)導雕(diao)亡(wang)的(de)同時，也(ye)可產生(sheng)細胞壞死(si)，這(zhe)取決(jue)於(yu)損(sun)傷(shang)的(de)劇(ju)烈程(cheng)度(du)和(he)細(xi)胞本身對(dui)刺(ci)激的(de)敏感程(cheng)度(du)。

三(san)尖(jian)杉(shan)酯(zhi)堿（HT）是我國(guo)自行研(yan)制的(de)壹種(zhong)對(dui)急性(xing)粒(li)細(xi)胞白血(xue)病，急性(xing)單(dan)核白(bai)血(xue)病等(deng)有(you)良好療(liao)效(xiao)的(de)抗腫(zhong)瘤藥(yao)物。研(yan)究表(biao)明HT在(zai)0.02~5μg/ml範圍(wei)內作用2小(xiao)時，即(ji)可誘(you)導HL-60細胞雕(diao)亡(wang)，並(bing)表(biao)現(xian)出典型的(de)雕(diao)亡(wang)特(te)征(zheng)。本實(shi)驗用1μg/ml HT在(zai)體(ti)外誘(you)導培養的(de)HL-60細胞發(fa)生(sheng)雕(diao)亡(wang)，同時也(ye)有(you)少數(shu)細胞發(fa)生(sheng)壞(huai)死(si)。用Hoechst33342和(he)碘化丙(bing)啶(ding)（propidium iodide，PI）對(dui)細(xi)胞進行雙重染(ran)色(se)，可以區別雕(diao)亡(wang)、壞(huai)死(si)及正(zheng)常細胞。

 細胞膜是壹選擇(ze)性的(de)生物膜，壹般的(de)生物染料(liao)如(ru)PI等(deng)不能(neng)穿(chuan)過質膜。當(dang)細胞壞死(si)時，質膜不完整，PI就進入(ru)細(xi)胞內部，它可嵌(qian)入(ru)到DNA或(huo)RNA中(zhong)，使壞死(si)細胞著色(se)，雕(diao)亡(wang)細(xi)胞和(he)活(huo)細胞不著色(se)。而壹些(xie)活(huo)細胞染料(liao)由於(yu)為(wei)親脂性(xing)物(wu)質，可跨膜進(jin)入(ru)活(huo)細胞，因而可進(jin)行活細(xi)胞染色(se)。Hoechst33342是壹種(zhong)活(huo)性(xing)熒(ying)光(guang)染料(liao)且毒性較(jiao)弱，它(ta)是雙苯(ben)並(bing)咪唑的(de)壹種(zhong)衍(yan)生(sheng)物。與(yu)DNA特異(yi)結合(he)（主要結合(he)於(yu)A-T）堿基區），顯示雕(diao)亡(wang)細(xi)胞和(he)活(huo)細胞。凡是看到有(you)雕(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)的(de)細胞都是雕(diao)亡(wang)細(xi)胞。

三、實(shi)驗用品
1、試劑(ji)：三尖(jian)杉(shan)酯(zhi)堿（HT），300μg/ml，100mmol/L Tris-HCl（pH7.5），5mol/L EDTA緩沖(chong)液、堿性裂解(jie)液：0.2mol/L NaOH, 1%SDS、醋(cu)酸(suan)鈉：3mol/L KAc（pH4.8）；異(yi)丙(bing)醇；70%乙醇；溴酚(fen)藍，蔗(zhe)糖(tang)指(zhi)示劑(ji)。TBE電泳(yong)緩沖(chong)液，1%瓊(qiong)脂(zhi)糖(tang)，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母(mu)液：2mmol/L。
2、儀(yi)器(qi)設(she)備(bei)：熒光(guang)顯微鏡，電(dian)泳(yong)儀(yi)，電(dian)泳(yong)槽(cao)，移液槍(qiang),微量(liang)加樣(yang)器(qi)（1ml，100μl）0.5、1.5ml離(li)心管(guan)，載(zai)玻片(pian)，蓋(gai)玻片(pian)。

四(si)、實(shi)驗材(cai)料(liao)
人早(zao)幼(you)粒白(bai)血(xue)病HL-60細(xi)胞，用含10%小(xiao)牛血(xue)清(qing)的(de)RPMI1640培養基在(zai)37℃，5%CO2條件(jian)下(xia)培(pei)養。

五、方(fang)法(fa)步(bu)驟(zhou)
1、三(san)尖(jian)杉(shan)酯(zhi)堿誘(you)發(fa)HL-60細(xi)胞雕(diao)亡(wang)
（1）實(shi)驗前(qian)約24小(xiao)時，接(jie)種(zhong)兩(liang)瓶(ping)HL-60細胞，標記(ji)①、②，每(mei)瓶含約6ml培(pei)養液，置37℃，5%CO2培(pei)養箱培養。
（2）實(shi)驗前(qian)約2.5小(xiao)時，當(dang)細(xi)胞密度達(da)到70%，①號(hao)瓶加入(ru)三(san)尖(jian)杉(shan)酯(zhi)堿200μl，使終濃度(du)為(wei)1μg/ml，②號(hao)瓶中(zhong)加入(ru)同等(deng)量(liang)PBS（pH7.4）作對(dui)照(zhao)。共同放入(ru)培(pei)養箱中(zhong)繼續培養2.5小(xiao)時。
2、Ho33342和(he)PI雙(shuang)重染(ran)色(se)鑒別三種(zhong)細(xi)胞
（1）染色(se)：將瓶中(zhong)的(de)細胞搖(yao)勻(yun)取200μl於(yu)1.5ml的(de)離心管(guan)中(zhong)，加入(ru)Ho33342母(mu)液2μl，PI 20μl，染(ran)色(se)15分鐘(zhong)。
（2）滴(di)片(pian)：取壹(yi)載(zai)玻片(pian)用雙面(mian)膠(jiao)圍成壹(yi)小(xiao)室，從離心管(guan)中(zhong)各取以上染(ran)色(se)後的(de)細胞懸(xuan)液10μl，加入(ru)小(xiao)室內(nei)蓋(gai)上蓋(gai)玻片(pian)，熒(ying)光(guang)鏡下(xia)用紫(zi)外激發(fa)光(guang)，高(gao)倍鏡下(xia)觀察(cha)，區別三種(zhong)細(xi)胞，並註(zhu)意三(san)者比(bi)例。

註(zhu)意事(shi)項(xiang)
1. 誘(you)導培養HL-60細胞時間要準(zhun)確(que)；
2. 熒光顯微鏡下(xia)觀察(cha)細(xi)胞時，由於(yu)熒(ying)光易碎(sui)滅，觀察(cha)時(shi)要盡(jin)量(liang)快。

其(qi)他(ta)
細(xi)胞死(si)亡根(gen)據(ju)其性(xing)質、起源(yuan)及生(sheng)物(wu)學(xue)意(yi)義(yi)區分為(wei)雕(diao)亡(wang)和(he)壞(huai)死(si)兩(liang)種(zhong)不同類(lei)型。雕(diao)亡(wang)普(pu)遍(bian)存在(zai)於(yu)生(sheng)命界(jie)，在(zai)生物(wu)個體(ti)和(he)生(sheng)存中(zhong)起著非(fei)常(chang)重要(yao)的(de)作用。它是細胞在(zai)壹定(ding)生理(li)條(tiao)件下(xia)壹(yi)系(xi)列(lie)順(shun)序(xu)發(fa)生(sheng)事(shi)件的(de)組合(he)，是細胞遵循(xun)壹定規律(lv)自己(ji)結束(shu)生(sheng)命的(de)自主控(kong)制過程(cheng)。細(xi)胞雕(diao)亡(wang)具(ju)有(you)可鑒別的(de)形(xing)態(tai)學(xue)和(he)生(sheng)物化學(xue)特(te)征(zheng)。
 
在(zai)形(xing)態(tai)上可見(jian)雕(diao)亡(wang)細(xi)胞與(yu)周圍細胞脫離(li)接(jie)觸，細胞變園，細胞膜向內皺(zhou)縮(suo)、胞漿濃縮(suo)、內(nei)質網擴(kuo)張、細胞核固(gu)縮(suo)破裂呈(cheng)團(tuan)塊狀(zhuang)或(huo)新月(yue)狀(zhuang)分布、內(nei)質網和(he)細(xi)胞膜進壹步(bu)融(rong)合(he)將(jiang)細(xi)胞分成(cheng)多個完整包(bao)裹的(de)雕(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)，雕(diao)亡(wang)小(xiao)體(ti)最後(hou)被吞噬(shi)細(xi)胞吞噬(shi)消(xiao)化。在(zai)雕(diao)亡(wang)過程(cheng)中(zhong)細胞內容物並(bing)不釋(shi)放到細(xi)胞外，不會(hui)影響(xiang)其(qi)它(ta)細胞，因而不引起炎(yan)癥反(fan)應(ying)。
 
在(zai)生物(wu)化學(xue)上，多數(shu)細胞雕(diao)亡(wang)的(de)過程(cheng)中(zhong)，內源性核酸(suan)內切酶(mei)活化，活性(xing)增加。核DNA隨(sui)機地(di)在(zai)核小(xiao)體(ti)的(de)連(lian)接部(bu)位(wei)被(bei)酶(mei)切斷(duan)，降解為(wei)180-200bp或它(ta)的(de)整倍數的(de)各種(zhong)片(pian)斷(duan)。如(ru)果(guo)對(dui)核DNA進(jin)行瓊脂(zhi)糖(tang)電(dian)泳(yong)，可顯示以180-200bp為(wei)基數的(de)DNA ladder（梯狀(zhuang)帶(dai)紋(wen)）的(de)特征(zheng)。
相比(bi)之下(xia)，壞(huai)死(si)是細胞處於(yu)劇(ju)烈損傷(shang)條件下(xia)發(fa)生(sheng)的(de)細胞死(si)亡。細(xi)胞在(zai)壞死(si)早(zao)期即(ji)喪(sang)失質膜完整性，各種(zhong)細(xi)胞器(qi)膨(peng)脹，進(jin)而(er)質膜崩解(jie)釋(shi)放出其中(zhong)的(de)內容物，引起炎(yan)癥反(fan)應(ying)，壞(huai)死(si)過程(cheng)中(zhong)細胞核DNA雖(sui)也(ye)降解，但由(you)於(yu)存在(zai)各種(zhong)長(chang)度(du)不等(deng)的(de)DNA片(pian)斷(duan)，不能(neng)形(xing)成(cheng)梯(ti)狀(zhuang)帶(dai)紋(wen)，而呈(cheng)彌散(san)狀(zhuang)。
     
壹(yi)些(xie)溫(wen)和(he)的(de)損傷(shang)刺(ci)激及壹(yi)些(xie)抗腫(zhong)瘤藥(yao)物可誘(you)導細胞雕(diao)亡(wang)，通(tong)常(chang)這(zhe)些(xie)因(yin)素在(zai)誘(you)導雕(diao)亡(wang)的(de)同時，也(ye)可產生(sheng)細胞壞死(si)，這(zhe)取決(jue)於(yu)損(sun)傷(shang)的(de)劇(ju)烈程(cheng)度(du)和(he)細(xi)胞本身對(dui)刺(ci)激的(de)敏感程(cheng)度(du)。