菌(jun)種保(bao)存常(chang)用(yong)的五種方法(fa)

各種微生物(wu)由(you)於(yu)遺傳(chuan)特性(xing)不同(tong)，因此(ci)適合采用(yong)的保(bao)藏方法(fa)也不壹(yi)樣。壹種良好的有(you)效保(bao)藏方法(fa)，首先應(ying)能(neng)保(bao)持(chi)原(yuan)菌(jun)種的優(you)良(liang)性(xing)狀(zhuang)長期不(bu)變，同(tong)時(shi)還須考慮(lv)方法(fa)的(de)通(tong)用(yong)性(xing)、操作的(de)簡(jian)便(bian)性(xing)和設(she)備(bei)的(de)普及(ji)性(xing)。下面(mian)介紹(shao)幾(ji)種常用(yong)的菌種保(bao)藏方法(fa)：

1.斜(xie)面(mian)低(di)溫保(bao)藏法(fa)

將菌種接種在適宜的斜面培(pei)養基(ji)上(shang)，待(dai)菌種生長完成(cheng)後(hou)，置於(yu)4℃左(zuo)右的(de)冰(bing)箱(xiang)中保(bao)藏，每隔壹定時(shi)間(jian)（保(bao)藏期）再(zai)轉接(jie)至(zhi)新的(de)斜(xie)面(mian)培(pei)養基(ji)上(shang)，生(sheng)長後(hou)繼續(xu)保(bao)藏，如此(ci)連(lian)續(xu)不斷。此(ci)法(fa)廣泛(fan)適用(yong)於細(xi)菌(jun)、放線(xian)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)菌(jun)和(he)黴(mei)菌等大多(duo)數微生物(wu)菌(jun)種的短期保(bao)藏及(ji)不宜用(yong)冷凍幹燥保(bao)藏的菌(jun)種。

放線(xian)菌(jun)、黴菌(jun)和有(you)芽孢(bao)的細(xi)菌(jun)壹(yi)般可(ke)保(bao)存6個(ge)月左(zuo)右，無(wu)芽(ya)孢的細(xi)菌(jun)可(ke)保(bao)存1個(ge)月左(zuo)右，酵(jiao)母(mu)菌(jun)可(ke)保(bao)存3個(ge)月左(zuo)右。如(ru)以(yi)橡皮塞(sai)代替棉塞(sai)，再(zai)用(yong)石(shi)蠟封(feng)口(kou)，置於(yu)4℃冰(bing)箱(xiang)中保(bao)藏，不僅(jin)能(neng)防止水(shui)分(fen)揮發(fa)、能(neng)隔氧，而且能(neng)防止棉塞(sai)受(shou)潮(chao)而汙(wu)染(ran)。這壹改進可(ke)使(shi)菌種的保(bao)藏期延(yan)長。

此(ci)法(fa)由(you)於(yu)采(cai)用(yong)低溫保(bao)藏，大大(da)減(jian)緩了微生(sheng)物(wu)的(de)代謝繁殖速(su)度，降(jiang)低突(tu)變(bian)頻(pin)率(lv)；同(tong)時(shi)也減少(shao)了培(pei)養基(ji)的(de)水(shui)分(fen)蒸(zheng)發(fa)，使(shi)其不(bu)至(zhi)於(yu)幹(gan)裂。該(gai)法(fa)的(de)優(you)點(dian)是(shi)簡(jian)便(bian)易(yi)行(xing)，容(rong)易(yi)推(tui)廣，存活(huo)率(lv)高(gao)，故(gu)科(ke)研(yan)和(he)生(sheng)產(chan)上對(dui)經(jing)常使(shi)用(yong)的菌種大多采用(yong)這種保(bao)藏方法(fa)。其缺點(dian)是(shi)菌(jun)株仍(reng)有(you)壹定(ding)程度(du)的代謝活(huo)動(dong)能(neng)力，保(bao)藏期短(duan)，傳(chuan)代次數多，菌(jun)種較容易(yi)發(fa)生(sheng)變(bian)異(yi)和被汙(wu)染(ran)。

2.石(shi)蠟油封(feng)藏法(fa)

此(ci)法(fa)是(shi)在無(wu)菌條(tiao)件(jian)下，將滅(mie)過菌(jun)並已蒸(zheng)發(fa)掉(diao)水分(fen)的液體石(shi)蠟倒入培(pei)養成(cheng)熟(shu)的(de)菌(jun)種斜面（或半(ban)固(gu)體穿刺培(pei)養物(wu)）上(shang)，石(shi)蠟油層(ceng)高(gao)出斜(xie)面頂端(duan)lcm，使(shi)培(pei)養物(wu)與(yu)空氣(qi)隔(ge)絕(jue)，加(jia)膠塞(sai)並用(yong)固體石(shi)蠟封(feng)口(kou)後(hou)，垂(chui)直放在室(shi)溫或(huo)4℃冰(bing)箱(xiang)內保(bao)藏。使(shi)用(yong)的液體石(shi)蠟要求(qiu)優(you)質無毒(du)，化學(xue)純(chun)規(gui)格(ge)，其滅(mie)菌條(tiao)件(jian)是：150～170℃烘(hong)箱(xiang)內滅(mie)菌lh；或(huo)121℃高(gao)壓蒸(zheng)汽(qi)滅(mie)菌60～80min，再(zai)置於(yu)80℃的烘箱(xiang)內烘(hong)幹除去(qu)水分(fen)。

由於(yu)液體石(shi)蠟阻隔了空氣(qi)，使(shi)菌體處於(yu)缺氧狀(zhuang)態(tai)下，而且又(you)防止了水分(fen)揮發(fa)，使(shi)培(pei)養物(wu)不(bu)會幹裂(lie)，因而能(neng)使(shi)保(bao)藏期達(da)1～2年(nian)，或(huo)更(geng)長。這種方法(fa)操作簡(jian)單(dan)，它適於保(bao)藏黴菌(jun)、酵(jiao)母(mu)菌(jun)、放線(xian)菌(jun)、好氧性(xing)細(xi)菌(jun)等(deng)，對黴(mei)菌和酵(jiao)母(mu)菌(jun)的(de)保(bao)藏效果(guo)較好(hao)，可(ke)保(bao)存幾(ji)年(nian)，甚(shen)至(zhi)長達10年(nian)。但(dan)對很多厭氧性(xing)細(xi)菌(jun)的(de)保(bao)藏效果(guo)較差，尤其不(bu)適用(yong)於某些能(neng)分(fen)解烴(ting)類的(de)菌種。

有(you)試驗(yan)指出，此(ci)法(fa)用(yong)於保(bao)藏紅(hong)曲黴(mei)很合適，保(bao)藏1～2年(nian)後(hou)存活(huo)率(lv)為(wei)100％；也有(you)報(bao)道(dao)顯示(shi)，某(mou)些蕈菌菌(jun)絲用(yong)石(shi)蠟油保(bao)藏法(fa)，在3～6℃保(bao)藏時(shi)菌絲易(yi)於(yu)死(si)亡，而在室(shi)溫下(xia)反而較理(li)想(xiang)，這(zhe)是(shi)值得(de)註意的(de)。

3.甘油懸液保(bao)藏法(fa)

此(ci)法(fa)是(shi)將菌種懸浮(fu)在甘油蒸(zheng)餾水中，置於(yu)低溫下(xia)保(bao)藏，本法(fa)較(jiao)簡(jian)便(bian)，但(dan)需置備(bei)低溫冰(bing)箱(xiang)。保(bao)藏溫度(du)若(ruo)采用(yong)-20℃，保(bao)藏期約(yue)為(wei)0.5～1年(nian)，而采用(yong)-70℃，保(bao)藏期可(ke)達10年(nian)。

將擬保(bao)藏菌種對數期的(de)培(pei)養液直接(jie)與(yu)經121℃蒸(zheng)汽(qi)滅(mie)菌20min的(de)甘油混合(he)，並使(shi)甘油的終濃度(du)在10％～15％，再(zai)分(fen)裝(zhuang)於小離(li)心管中，置低(di)溫冰(bing)箱(xiang)中保(bao)藏。基因工(gong)程(cheng)菌(jun)常(chang)采(cai)用(yong)本法(fa)保(bao)藏。

4.凍幹保(bao)藏法(fa)

冷凍真空幹(gan)燥保(bao)藏法(fa)又(you)稱(cheng)冷凍幹燥保(bao)藏法(fa)，簡(jian)稱(cheng)凍幹法(fa)。它(ta)通(tong)常(chang)是(shi)用(yong)保(bao)護劑(ji)制備(bei)擬(ni)保(bao)藏菌種的細(xi)胞懸(xuan)液或孢(bao)子(zi)懸液於安瓿管中，再(zai)在低(di)溫下(xia)快速(su)將含菌(jun)樣凍結，並減壓抽(chou)真(zhen)空，使(shi)水升華將樣品脫(tuo)水(shui)幹(gan)燥，形(xing)成(cheng)幹燥的(de)固體菌塊(kuai)。並在真(zhen)空條(tiao)件(jian)下立(li)即融封(feng)，造(zao)成(cheng)無氧真(zhen)空環(huan)境，最(zui)後(hou)置於(yu)低溫下(xia)，使(shi)微生物(wu)處於(yu)休(xiu)眠(mian)狀(zhuang)態(tai)，而得以(yi)長期保(bao)藏。常用(yong)的保(bao)護劑(ji)有(you)脫(tuo)脂(zhi)牛奶、血清、澱(dian)粉(fen)、葡(pu)聚糖(tang)等高(gao)分(fen)子物(wu)質。

由於(yu)此(ci)法(fa)同(tong)時(shi)具(ju)備低(di)溫、幹(gan)燥、缺氧的(de)菌(jun)種保(bao)藏條(tiao)件(jian)，因此(ci)保(bao)藏期長，壹般達(da)5～15年(nian)，存活(huo)率(lv)高(gao)，變異(yi)率低(di)，是目前被廣泛(fan)采(cai)用(yong)的壹種較理(li)想(xiang)的(de)保(bao)藏方法(fa)。除不(bu)產(chan)孢子(zi)的(de)絲狀(zhuang)真(zhen)菌不(bu)宜用(yong)此(ci)法(fa)外，其他(ta)大多數微生(sheng)物(wu)如(ru)病毒(du)、細(xi)菌(jun)、放線(xian)菌(jun)、酵(jiao)母(mu)菌(jun)、絲狀(zhuang)真(zhen)菌等(deng)均可(ke)采用(yong)這種保(bao)藏方法(fa)。但(dan)該法(fa)操作比(bi)較(jiao)煩瑣，技術要求(qiu)較高(gao)，且需(xu)要凍幹機等(deng)設備。

5.液氮(dan)超(chao)低溫保(bao)藏法(fa)

液氮(dan)超(chao)低溫保(bao)藏法(fa)簡(jian)稱(cheng)液氮(dan)保(bao)藏法(fa)或(huo)液氮(dan)法(fa)。它(ta)是(shi)以(yi)甘油、二甲基(ji)亞碸(feng)等(deng)作為(wei)保(bao)護劑(ji)，在液氮(dan)超(chao)低溫（-196℃）下(xia)保(bao)藏的方(fang)法(fa)。其主(zhu)要(yao)原理(li)是(shi)菌(jun)種細(xi)胞從(cong)常(chang)溫過(guo)渡到低(di)溫，並在降(jiang)到低溫之(zhi)前，使(shi)細(xi)胞內(nei)的(de)自由(you)水(shui)通(tong)過細(xi)胞膜(mo)外滲(shen)出來，以免膜(mo)內(nei)因自(zi)由(you)水(shui)凝結成(cheng)冰(bing)晶而使(shi)細(xi)胞損(sun)傷(shang)。美(mei)國(guo)ATCC菌(jun)種保(bao)藏中心采(cai)用(yong)該法(fa)時(shi)，把(ba)菌懸(xuan)液或帶(dai)菌(jun)絲的瓊脂(zhi)塊(kuai)經(jing)控(kong)制致(zhi)冷速(su)度，以(yi)每分(fen)鐘下(xia)降1℃/min的(de)速(su)度從(cong)0℃直(zhi)降到-35℃，然(ran)後(hou)保(bao)藏在-150℃～-196℃液氮(dan)冷箱(xiang)中。如果(guo)降溫速(su)度過(guo)快，由(you)於細(xi)胞內(nei)自(zi)由水(shui)來不及(ji)滲(shen)出胞外，形(xing)成(cheng)冰(bing)晶就(jiu)會損(sun)傷(shang)細(xi)胞。據(ju)研究認(ren)為(wei)降溫的(de)速(su)度控(kong)制在（1～10）℃/min，細(xi)胞死(si)亡率低；隨(sui)著(zhe)速(su)度加(jia)快，死(si)亡率則相應(ying)提(ti)高(gao)。

液氮(dan)低溫保(bao)藏的保(bao)護劑(ji)，壹般是(shi)選擇(ze)甘油、二甲基(ji)亞碸(feng)、糊(hu)精、血(xue)清蛋(dan)白(bai)、聚(ju)乙烯(xi)氮(dan)戊環、吐溫80等(deng)，但(dan)常用(yong)的是甘油（10%～20%）。不同(tong)微生(sheng)物(wu)要(yao)選(xuan)擇(ze)不(bu)同(tong)的保(bao)護劑(ji)，再(zai)通過(guo)試(shi)驗(yan)加以確定保(bao)護劑(ji)的濃(nong)度(du)，原則上是控(kong)制在不(bu)足以造(zao)成(cheng)微生物(wu)致(zhi)死(si)的(de)濃度。

此(ci)法(fa)操作簡(jian)便(bian)、高(gao)效、保(bao)藏期壹(yi)般可(ke)達到15年(nian)以(yi)上，是目前(qian)菌(jun)種長期保(bao)藏主要(yao)技(ji)術之壹(yi)。除了少數(shu)對低(di)溫損(sun)傷(shang)敏(min)感(gan)的(de)微(wei)生物(wu)外，該(gai)法(fa)適用(yong)於各種微生物(wu)菌(jun)種的保(bao)藏，甚(shen)至(zhi)連(lian)藻類、原(yuan)生動(dong)物(wu)、支(zhi)原(yuan)體等都能(neng)用(yong)此(ci)法(fa)獲得有(you)效的(de)保(bao)藏。此(ci)法(fa)的(de)另(ling)壹(yi)大(da)優(you)點(dian)是(shi)可(ke)使(shi)用(yong)各種培(pei)養形(xing)式的(de)微生物(wu)進行保(bao)藏，無論(lun)是孢(bao)子或(huo)菌體、液體培(pei)養物(wu)或(huo)固(gu)體培(pei)養物(wu)均(jun)可(ke)采用(yong)該保(bao)藏法(fa)。其缺點(dian)是(shi)需(xu)購(gou)置超(chao)低溫液氮(dan)設備，且(qie)液氮(dan)消耗(hao)較(jiao)多，操作費(fei)用(yong)較高(gao)。

要使(shi)用(yong)菌種時(shi)，從(cong)液氮(dan)罐中取(qu)出安瓿瓶，並迅速(su)放到(dao)35～40℃溫水(shui)中，使(shi)之冰(bing)凍熔化，以(yi)無(wu)菌操作打(da)開(kai)安瓿瓶，移(yi)接到(dao)保(bao)藏前使(shi)用(yong)的同(tong)壹種培(pei)養基(ji)斜(xie)面(mian)上進行培(pei)養。從(cong)液氮(dan)罐中取(qu)出安瓿瓶時(shi)速(su)度要(yao)快，壹(yi)般不(bu)超(chao)過1min，以防其他(ta)安瓿瓶升溫而影(ying)響保(bao)藏質量(liang)。並且取(qu)樣時(shi)壹定(ding)要(yao)戴專(zhuan)用(yong)手(shou)套以(yi)防止意(yi)外爆炸(zha)和(he)凍傷。

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